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yx_sun70

金虫 (正式写手)

[求助] 有用同源重组法进行基因克隆和载体构建的吗？ 已有1人参与

有用同源重组法进行基因克隆和载体构建的吗？这个技术比传统的ta克隆好用吗，做起来困难否？求教！
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1楼 2012-11-18 18:40:53
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回帖置顶 ( 共有1个 )

irenescbg

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
yx_sun70: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2012-11-23 14:30:31
kx444555: 金币+1, 还有INVITROGEN 的GATEWAY技术 2012-11-26 22:08:19
gyesang: 回帖置顶 2013-05-14 02:01:59
你是说的in fusion的方法做克隆吗？这里有介绍：
http://www.clontech.com/US/Produ ... ning_Kits-HD-Liquid

我们用的是这个。你可以直接PCR一个片段（引物设计有要求），把载体切成线性的，然后用同源重组的方法克隆，效果很好，尤其是找不到合适的酶切位点的时候更合适。现在我们用这个方法克隆了不少片段了。相比传统的TA克隆，这种方法可以直接克隆到目的载体中，不需要中间步骤。但是片段浓度要高。就是贵了点。不过我们每次就用2ul体系就可以了。
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请赐予我正能量吧！加油！
4楼2012-11-19 16:01:02
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普通回帖

gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
yx_sun70: 金币+1, ★有帮助, 多谢！ 2012-11-20 14:10:14
用同源重组方法构建载体是可以的，但一般这种用来改造病毒基因组，比如腺病毒基因组比较大50多kb
需要用到特殊的菌株，比如BJ5183这个菌株
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2012-11-18 18:55:23
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1514132

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
yx_sun70: 金币+1, ★有帮助 2012-11-23 14:30:49
yx_sun70(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-14 02:01:22
在昆虫杆状病毒表达系统上，也用到同源重组。感觉还好吧，不难

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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3楼2012-11-18 20:21:47
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biobiobio

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
yx_sun70: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-11-27 18:07:27
yx_sun70(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-14 02:01:40
相对TA克隆这种方法的优点是：
片段一步克隆到表达载体
不受载体和酶切位点限制
一次性可完成多片段无缝克隆
能解决传统方法难以解决的问题，成功率及阳性率真远高于传统克隆
缺点是一个是贵了点，in-fusion，国内的也有，便宜些clonexpress
另一个缺点是习惯问题，没用过这种方法的人第一次做不太习惯的，用久了挺好用的，很快
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5楼2012-11-26 20:45:17
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yx_sun70

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by biobiobio at 2012-11-26 20:45:17
相对TA克隆这种方法的优点是：
片段一步克隆到表达载体
不受载体和酶切位点限制
一次性可完成多片段无缝克隆
能解决传统方法难以解决的问题，成功率及阳性率真远高于传统克隆
缺点是一个是贵了点，in-fusion， ...

请问您用过国内的吗，那家公司的好用些？
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6楼2013-04-29 11:20:43
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yx_sun70

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by irenescbg at 2012-11-19 16:01:02
你是说的in fusion的方法做克隆吗？这里有介绍：
http://www.clontech.com/US/Products/Cloning_and_Competent_Cells/Cloning_Kits/Cloning_Kits-HD-Liquid

我们用的是这个。你可以直接PCR一个片段（引物设计有 ...

我们做的总出很多的假阳性克隆，已经排除不是酶切不完全的问题，不知您是否给些建议？怎么也想不出这些假阳性是怎么来的。
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7楼2013-05-13 17:29:22
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阿香1124

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

我用同源重组做小片段的连接挺好的，但是现在有一个要连一个片段，连接之后是11kb，转化板子上就是不长，求高人指导
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8楼2014-10-09 10:45:15
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yashangzhuo

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 阿香1124 at 2014-10-09 10:45:15
我用同源重组做小片段的连接挺好的，但是现在有一个要连一个片段，连接之后是11kb，转化板子上就是不长，求高人指导

请问你们怎么鉴定有没有重组上呢 我重组后与重组前就相差36 bp，PCR鉴定琼脂糖凝胶区分不了，老师建议重新设计引物，觉得麻烦，有更好的建议吗？
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9楼2015-06-02 16:48:56
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