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大肠杆菌Red重组法基因敲除求助 已有1人参与
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我做大肠杆菌基因敲除，用的gene bridge的red/etrecombinantion试剂盒，按照里面的步骤，现在出现如下问题： 用阿拉伯糖诱导与不用阿拉伯糖诱导的菌，转入重组片段后，kan筛选的板上长了很多很多，但是pcr全都验证不出来，也换了引物，kit中的阳性对照的菌都能扩出来。。。按照理论，应该是阿拉伯糖诱导了的才能启动重组，板上长出克隆，而没有诱导的菌转入重组片段不能发生重组，kan板上就不能长。。。备注，用kan处理没有转入片段的菌，菌不能长。。。 求高手指教，并分享经验，告诉我每一步应该注意什么，然后我优化优化条件，看能不能做出来，多谢各位 |
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1)看你使用的Kan浓度，由于重组替换是单拷贝，不如质粒表达强烈，一般要求常规用量一半的kn，当用量不准或kn失效都会造成假阳性；（2）涂板的稀释梯度问题，不能原液涂，要10倍稀释，否则有假阳性，一般1个平板会有10-100个正确克隆。（3)商家提供的试剂盒问题。如果觉得麻烦或经验不足，可以委托公司做，如：广州迈博生物科技有限公司 7楼2016-03-12 11:52:41
