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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 大肠杆菌Red重组法基因敲除求助
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hunzi

铁虫 (初入文坛)

[求助] 大肠杆菌Red重组法基因敲除求助 已有1人参与

我做大肠杆菌基因敲除，用的gene bridge的red/etrecombinantion试剂盒，按照里面的步骤，现在出现如下问题：
用阿拉伯糖诱导与不用阿拉伯糖诱导的菌，转入重组片段后，kan筛选的板上长了很多很多，但是pcr全都验证不出来，也换了引物，kit中的阳性对照的菌都能扩出来。。。按照理论，应该是阿拉伯糖诱导了的才能启动重组，板上长出克隆，而没有诱导的菌转入重组片段不能发生重组，kan板上就不能长。。。备注，用kan处理没有转入片段的菌，菌不能长。。。
求高手指教，并分享经验，告诉我每一步应该注意什么，然后我优化优化条件，看能不能做出来，多谢各位
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1楼 2012-12-24 20:29:25
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蜗牛-killer

金虫 (小有名气)
哥们 你问题解决了么 同问！！！！！！
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哇咔咔~
2楼2012-12-31 11:57:24
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stardu

新虫 (初入文坛)
同问同问呀！！！！
现在我也做不出来。
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3楼2013-05-13 09:15:34
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bolysu

禁虫 (著名写手)
本帖内容被屏蔽
4楼2013-05-13 14:24:42
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hunzi

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 蜗牛-killer at 2012-12-31 11:57:24
哥们 你问题解决了么 同问！！！！！！

木有做出来
在日本某家公司买的敲出菌
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5楼2013-09-07 14:56:30
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hunzi

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by bolysu at 2013-05-13 14:24:42
用的质粒都没说，怎么求助？我敲除用的氨苄筛选。

是公司的试剂盒。。。
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6楼2013-09-07 14:57:43
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oceanbird

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

这里有好几种可能1)看你使用的Kan浓度，由于重组替换是单拷贝，不如质粒表达强烈，一般要求常规用量一半的kn，当用量不准或kn失效都会造成假阳性；（2）涂板的稀释梯度问题，不能原液涂，要10倍稀释，否则有假阳性，一般1个平板会有10-100个正确克隆。（3)商家提供的试剂盒问题。如果觉得麻烦或经验不足，可以委托公司做，如：广州迈博生物科技有限公司
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7楼2016-03-12 11:52:41
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