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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » red基因敲除
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thestormcong

银虫 (小有名气)

[求助] red基因敲除

大家好，最近做red基因敲除，遇到困难，特地请求高人指点。
      我将带有同源臂的打靶片段电转化入宿主细胞中，筛选转化子（我用的是卡纳抗性）。对转化子进行菌落pcr，菌落pcr的引物设计在待敲除基因的上下游。我挑了6个转化子，也做了阳性对照（原始株）。结果是有一个有条带，大小跟野生株的一样。另外5个都没有条带。我很纳闷！理论上来说的话应该都能扩增出条带，只是大小不同，可是为什么我有5个都没有能够扩增出条带呢？
      自己也分析了一下原因。
     1：有可能是其他带有卡纳抗性的菌株的污染。可是我对这些菌株的别的基因进
行过菌落pcr（实验室有做该细菌别的基因），都是有条带的，表明这些还是我的菌株。
    2：会不会是里面的同源交换出错了呢？但是细菌还是有卡纳抗性的。也对这个细菌提过质粒，没有发现质粒条带。
   3：菌落pcr的问题吗？可是每一次的阳性对照都很正常啊。
综上所述，希望得到有经验的虫友的帮助，万分感谢！！！！！！！！
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1楼 2012-04-25 21:13:05
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

fenghan06

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

另外5个都没有条带。我很纳闷！理论上来说的话应该都能扩增出条带，只是大小不同，可是为什么我有5个都没有能够扩增出条带呢？ - 楼主， 你用的pKD3没有使用restriction enzyme处理过.

我从来都没有digest过， 不过2000年的PNAS paper里面， 他们是有处理过的， 具体哪个酶我忘记了。 在PCR purification的时候， 我知道的一件事情是质粒也是可以通过column的。 解决的办法可以有2:
1. restriction, 或者，
2. 如果你实验室里已经有一个菌种chromosome里有Kan片断，使用extracted genomic DNA做PCR扩增

另外我在另外那个帖子里回你了， 如果使用一小时的话， 成功率是很低的， 所以基本上你盘里出现的大多都是因为你用来做扩增得pKD4带来的Kan resistance. 很久以前我们实验室就有人和Datsenko他们电邮联系过了， 他们那时候说， 把那一毫升的sample搁置到第二天成功率更高， 和我们实验室modified过后的protocol是类似道理的。
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17楼2012-06-28 22:43:56
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普通回帖

张宏宇123

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-04-26 16:03:03
你的对照菌株确定是没有卡纳抗性的吗？
同源交换错误也肯定有完整基因的片段，不能扩增不出来啊？
你确定一下看看你的打靶片段是不是正确，测序是否正确。
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未来不是梦
2楼2012-04-25 22:45:27
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thestormcong

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 张宏宇123 at 2012-04-25 22:45:27:
你的对照菌株确定是没有卡纳抗性的吗？
同源交换错误也肯定有完整基因的片段，不能扩增不出来啊？
你确定一下看看你的打靶片段是不是正确，测序是否正确。

恩，谢谢你的意见。我的原始株是没有卡纳抗性的，这个是肯定的。我的打靶片断也是用保真性高的酶跑的，应该不会错吧，测序是没有测过的。
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3楼2012-04-25 23:18:54
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fwks3518

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-04-27 13:39:39
煮菌时间要足够长，你最好用野生型菌株一起煮，做个阳性对照。这样才好解释。
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4楼2012-04-26 08:44:38
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renqing001

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
thestormcong: 金币+5 2012-04-26 15:09:45
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-04-26 16:03:21
同源重组只发生在一条染色体，筛选引物应该设计在替换上去的卡那抗性基因上和短臂的外侧才合适，而不是待敲除的基因两侧，再有不要盲目相信菌落PCR，还是提DNA再做吧！
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thestormcong
无咎无誉
5楼2012-04-26 09:20:21
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thestormcong

银虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
5楼: Originally posted by renqing001 at 2012-04-26 09:20:21:
同源重组只发生在一条染色体，筛选引物应该设计在替换上去的卡那抗性基因上和短臂的外侧才合适，而不是待敲除的基因两侧，再有不要盲目相信菌落PCR，还是提DNA再做吧！

谢谢你的意见！如果只发生在一条染色体，意思就是说只在上游，或者下游一端发生双链同源重组吗？如果是这样的话卡纳基因为什么能够置换上去呢？还是说是只有单链DNA发生交换？小弟学识不深，请求指点。
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6楼2012-04-26 11:39:50
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thestormcong

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by fwks3518 at 2012-04-26 08:44:38:
煮菌时间要足够长，你最好用野生型菌株一起煮，做个阳性对照。这样才好解释。

谢谢，菌落pcr的确也是个问题。
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7楼2012-04-26 11:40:09
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小兔子乖乖1

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
thestormcong: 金币+3 2012-04-26 15:09:55
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-04-27 13:39:54
你的引物应该设计在kan抗性上和同源臂外的基因上。这样敲除掉了一定能p出来，没敲掉的就p不出来
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8楼2012-04-26 14:44:26
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thestormcong

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 小兔子乖乖1 at 2012-04-26 14:44:26:
你的引物应该设计在kan抗性上和同源臂外的基因上。这样敲除掉了一定能p出来，没敲掉的就p不出来

恩，是个好方法。可是如果同源重组正常的话，从基因的上下游pcr，应该也能把整段序列给扩增出来的吧。
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9楼2012-04-26 15:09:32
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thestormcong

银虫 (小有名气)
顶起啊，有经验的种子留个脚印吧！
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10楼2012-04-26 22:38:44
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