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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » red基因敲除
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huiee

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-04-27 13:40:24
引用回帖:
6楼: Originally posted by thestormcong at 2012-04-26 11:39:50:
谢谢你的意见！如果只发生在一条染色体，意思就是说只在上游，或者下游一端发生双链同源重组吗？如果是这样的话卡纳基因为什么能够置换上去呢？还是说是只有单链DNA发生交换？小弟学识不深，请求指点。

你做的是E.coli吗？   
E.coli 只有一条染色体吧，‘同源重组只发生在一条染色体’这句话无法同意。有可能是抗性质粒（你P kan抗性的模版）转到菌里啦。
还有大家说的菌落PCR不靠谱，以及引物设计的不好，都有可能。
你的引物扩增野生菌和突变菌的大小分别是多少？踢基因组再PCR呗
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11楼2012-04-27 02:54:36
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thestormcong

银虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by huiee at 2012-04-27 02:54:36:
你做的是E.coli吗？   
E.coli 只有一条染色体吧，‘同源重组只发生在一条染色体’这句话无法同意。有可能是抗性质粒（你P kan抗性的模版）转到菌里啦。
还有大家说的菌落PCR不靠谱，以及引物设计的不好，都有 ...

恩。非常感谢你的意见。我做的也是大肠杆菌K系列的菌株，我转的pcr产物也是经过DpnI处理，转化子也可能混有模板质粒，可如果是这种情况的话，鉴定引物pcr的结果应该也是跟野生株一样。我的野生株的pcr结果是1000bp左右，卡纳抗性置换后应该是1600bp左右。菌落pcr有可能会不稳定，可是每次我的对照（野生株）的条带都是正常的。
     现在觉得可能还是同源重组的问题，可我不知道到底是怎么回事，很纠结，没有一个对的转化子能够鉴定出来。
   
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12楼2012-04-27 09:24:42
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lincy2010

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-04-28 10:26:05
thestormcong: 金币+6, 好的，谢谢你的回答，真不知道是什么原因，那我就再重新设计看看，希望能有结果。 2012-04-28 18:45:14
建议楼主换验证引物，换成7楼所说的方式设计引物。我之前做RED重组时也是如楼主一下设计引物，效果很不理想，但又觉得自己的过程没有错误，重新设计了验证引物，共设计两对，分别P下重组后包含上下游同源臂的片段，测序都正确。后来验证引物都这么设计了。
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耐得住寂寞，方能遇见繁华
13楼2012-04-28 10:04:02
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renqing001

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-04-29 17:43:51
引用回帖:
6楼: Originally posted by thestormcong at 2012-04-26 11:39:50:
谢谢你的意见！如果只发生在一条染色体，意思就是说只在上游，或者下游一端发生双链同源重组吗？如果是这样的话卡纳基因为什么能够置换上去呢？还是说是只有单链DNA发生交换？小弟学识不深，请求指点。

建议你还是再深入看一下这方面的知识，同源重组一般需要两个同源片段同时交换才能将标记基因换上，因此不可能只是一端重组就能办到，即使是标记基因把靶基因替换下来，别忘了还有一条染色体是未改造的野生型，你把引物设计在敲除基因两侧，不是无视这个野生型的存在吗？
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无咎无誉
14楼2012-04-28 20:52:54
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renqing001

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by thestormcong at 2012-04-26 11:39:50:
谢谢你的意见！如果只发生在一条染色体，意思就是说只在上游，或者下游一端发生双链同源重组吗？如果是这样的话卡纳基因为什么能够置换上去呢？还是说是只有单链DNA发生交换？小弟学识不深，请求指点。

不好意思，没看清楚你是做原核的，我说的是做真核的，有些误导你了，抱歉啊！
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无咎无誉
15楼2012-04-28 21:04:25
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thestormcong

银虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by renqing001 at 2012-04-28 21:04:25:
不好意思，没看清楚你是做原核的，我说的是做真核的，有些误导你了，抱歉啊！

谢谢你的回帖哈，相互交流学习嘛，也能让我长长见识。
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16楼2012-04-29 09:00:09
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fenghan06

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

另外5个都没有条带。我很纳闷！理论上来说的话应该都能扩增出条带，只是大小不同，可是为什么我有5个都没有能够扩增出条带呢？ - 楼主， 你用的pKD3没有使用restriction enzyme处理过.

我从来都没有digest过， 不过2000年的PNAS paper里面， 他们是有处理过的， 具体哪个酶我忘记了。 在PCR purification的时候， 我知道的一件事情是质粒也是可以通过column的。 解决的办法可以有2:
1. restriction, 或者，
2. 如果你实验室里已经有一个菌种chromosome里有Kan片断，使用extracted genomic DNA做PCR扩增

另外我在另外那个帖子里回你了， 如果使用一小时的话， 成功率是很低的， 所以基本上你盘里出现的大多都是因为你用来做扩增得pKD4带来的Kan resistance. 很久以前我们实验室就有人和Datsenko他们电邮联系过了， 他们那时候说， 把那一毫升的sample搁置到第二天成功率更高， 和我们实验室modified过后的protocol是类似道理的。
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17楼2012-06-28 22:43:56
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fenghan06

银虫 (小有名气)
刚才才看到楼主提到有用酶处理过，不过还是有一定的几率有一定的质粒不会被剪到， 通常我会把buffer, 酶和质粒混合后再转到一个新的eppendorf里面来避免一部分质粒贴在eppendorf的边上，没接触到酶

希望实验顺利
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18楼2012-06-28 22:48:07
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