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thestormcong

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专业: 生物化学

[求助] red基因敲除

大家好，最近做red基因敲除，遇到困难，特地请求高人指点。
   我将带有同源臂的打靶片段电转化入宿主细胞中，筛选转化子（我用的是卡纳抗性）。对转化子进行菌落pcr，菌落pcr的引物设计在待敲除基因的上下游。我挑了6个转化子，也做了阳性对照（原始株）。结果是有一个有条带，大小跟野生株的一样。另外5个都没有条带。我很纳闷！理论上来说的话应该都能扩增出条带，只是大小不同，可是为什么我有5个都没有能够扩增出条带呢？
   自己也分析了一下原因。
   1：有可能是其他带有卡纳抗性的菌株的污染。可是我对这些菌株的别的基因进
行过菌落pcr（实验室有做该细菌别的基因），都是有条带的，表明这些还是我的菌株。
2：会不会是里面的同源交换出错了呢？但是细菌还是有卡纳抗性的。也对这个细菌提过质粒，没有发现质粒条带。
3：菌落pcr的问题吗？可是每一次的阳性对照都很正常啊。
综上所述，希望得到有经验的虫友的帮助，万分感谢！！！！！！！！

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1楼 2012-04-25 21:13:05

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thestormcong

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引用回帖:

11楼: Originally posted by huiee at 2012-04-27 02:54:36:
你做的是E.coli吗？
E.coli 只有一条染色体吧，‘同源重组只发生在一条染色体’这句话无法同意。有可能是抗性质粒（你P kan抗性的模版）转到菌里啦。
还有大家说的菌落PCR不靠谱，以及引物设计的不好，都有 ...

恩。非常感谢你的意见。我做的也是大肠杆菌K系列的菌株，我转的pcr产物也是经过DpnI处理，转化子也可能混有模板质粒，可如果是这种情况的话，鉴定引物pcr的结果应该也是跟野生株一样。我的野生株的pcr结果是1000bp左右，卡纳抗性置换后应该是1600bp左右。菌落pcr有可能会不稳定，可是每次我的对照（野生株）的条带都是正常的。
现在觉得可能还是同源重组的问题，可我不知道到底是怎么回事，很纠结，没有一个对的转化子能够鉴定出来。