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thestormcong银虫 (小有名气)
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red基因敲除
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大家好，最近做red基因敲除，遇到困难，特地请求高人指点。 我将带有同源臂的打靶片段电转化入宿主细胞中，筛选转化子（我用的是卡纳抗性）。对转化子进行菌落pcr，菌落pcr的引物设计在待敲除基因的上下游。我挑了6个转化子，也做了阳性对照（原始株）。结果是有一个有条带，大小跟野生株的一样。另外5个都没有条带。我很纳闷！理论上来说的话应该都能扩增出条带，只是大小不同，可是为什么我有5个都没有能够扩增出条带呢？ 自己也分析了一下原因。 1：有可能是其他带有卡纳抗性的菌株的污染。可是我对这些菌株的别的基因进 行过菌落pcr（实验室有做该细菌别的基因），都是有条带的，表明这些还是我的菌株。 2：会不会是里面的同源交换出错了呢？但是细菌还是有卡纳抗性的。也对这个细菌提过质粒，没有发现质粒条带。 3：菌落pcr的问题吗？可是每一次的阳性对照都很正常啊。 综上所述，希望得到有经验的虫友的帮助，万分感谢！！！！！！！！ |
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【答案】应助回帖
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另外5个都没有条带。我很纳闷！理论上来说的话应该都能扩增出条带，只是大小不同，可是为什么我有5个都没有能够扩增出条带呢？ - 楼主， 你用的pKD3没有使用restriction enzyme处理过. 我从来都没有digest过， 不过2000年的PNAS paper里面， 他们是有处理过的， 具体哪个酶我忘记了。 在PCR purification的时候， 我知道的一件事情是质粒也是可以通过column的。 解决的办法可以有2: 1. restriction, 或者， 2. 如果你实验室里已经有一个菌种chromosome里有Kan片断，使用extracted genomic DNA做PCR扩增 另外我在另外那个帖子里回你了， 如果使用一小时的话， 成功率是很低的， 所以基本上你盘里出现的大多都是因为你用来做扩增得pKD4带来的Kan resistance. 很久以前我们实验室就有人和Datsenko他们电邮联系过了， 他们那时候说， 把那一毫升的sample搁置到第二天成功率更高， 和我们实验室modified过后的protocol是类似道理的。 |
17楼2012-06-28 22:43:56
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【答案】应助回帖
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| 同源重组只发生在一条染色体，筛选引物应该设计在替换上去的卡那抗性基因上和短臂的外侧才合适，而不是待敲除的基因两侧，再有不要盲目相信菌落PCR，还是提DNA再做吧！ |
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thestormcong5楼2012-04-26 09:20:21
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