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thestormcong

银虫 (小有名气)

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[求助] red基因敲除

大家好，最近做red基因敲除，遇到困难，特地请求高人指点。
   我将带有同源臂的打靶片段电转化入宿主细胞中，筛选转化子（我用的是卡纳抗性）。对转化子进行菌落pcr，菌落pcr的引物设计在待敲除基因的上下游。我挑了6个转化子，也做了阳性对照（原始株）。结果是有一个有条带，大小跟野生株的一样。另外5个都没有条带。我很纳闷！理论上来说的话应该都能扩增出条带，只是大小不同，可是为什么我有5个都没有能够扩增出条带呢？
   自己也分析了一下原因。
   1：有可能是其他带有卡纳抗性的菌株的污染。可是我对这些菌株的别的基因进
行过菌落pcr（实验室有做该细菌别的基因），都是有条带的，表明这些还是我的菌株。
2：会不会是里面的同源交换出错了呢？但是细菌还是有卡纳抗性的。也对这个细菌提过质粒，没有发现质粒条带。
3：菌落pcr的问题吗？可是每一次的阳性对照都很正常啊。
综上所述，希望得到有经验的虫友的帮助，万分感谢！！！！！！！！

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1楼 2012-04-25 21:13:05

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renqing001

木虫 (著名写手)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
thestormcong: 金币+5 2012-04-26 15:09:45
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-04-26 16:03:21

同源重组只发生在一条染色体，筛选引物应该设计在替换上去的卡那抗性基因上和短臂的外侧才合适，而不是待敲除的基因两侧，再有不要盲目相信菌落PCR，还是提DNA再做吧！

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thestormcong

无咎无誉

5楼2012-04-26 09:20:21

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renqing001

木虫 (著名写手)

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【答案】应助回帖

★
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-04-29 17:43:51

引用回帖:

6楼: Originally posted by thestormcong at 2012-04-26 11:39:50:
谢谢你的意见！如果只发生在一条染色体，意思就是说只在上游，或者下游一端发生双链同源重组吗？如果是这样的话卡纳基因为什么能够置换上去呢？还是说是只有单链DNA发生交换？小弟学识不深，请求指点。

建议你还是再深入看一下这方面的知识，同源重组一般需要两个同源片段同时交换才能将标记基因换上，因此不可能只是一端重组就能办到，即使是标记基因把靶基因替换下来，别忘了还有一条染色体是未改造的野生型，你把引物设计在敲除基因两侧，不是无视这个野生型的存在吗？

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无咎无誉

14楼2012-04-28 20:52:54

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