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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » red基因敲除
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thestormcong

银虫 (小有名气)

[求助] red基因敲除

大家好，最近做red基因敲除，遇到困难，特地请求高人指点。
      我将带有同源臂的打靶片段电转化入宿主细胞中，筛选转化子（我用的是卡纳抗性）。对转化子进行菌落pcr，菌落pcr的引物设计在待敲除基因的上下游。我挑了6个转化子，也做了阳性对照（原始株）。结果是有一个有条带，大小跟野生株的一样。另外5个都没有条带。我很纳闷！理论上来说的话应该都能扩增出条带，只是大小不同，可是为什么我有5个都没有能够扩增出条带呢？
      自己也分析了一下原因。
     1：有可能是其他带有卡纳抗性的菌株的污染。可是我对这些菌株的别的基因进
行过菌落pcr（实验室有做该细菌别的基因），都是有条带的，表明这些还是我的菌株。
    2：会不会是里面的同源交换出错了呢？但是细菌还是有卡纳抗性的。也对这个细菌提过质粒，没有发现质粒条带。
   3：菌落pcr的问题吗？可是每一次的阳性对照都很正常啊。
综上所述，希望得到有经验的虫友的帮助，万分感谢！！！！！！！！
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1楼 2012-04-25 21:13:05
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thestormcong

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 小兔子乖乖1 at 2012-04-26 14:44:26:
你的引物应该设计在kan抗性上和同源臂外的基因上。这样敲除掉了一定能p出来，没敲掉的就p不出来

恩，是个好方法。可是如果同源重组正常的话，从基因的上下游pcr，应该也能把整段序列给扩增出来的吧。
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9楼2012-04-26 15:09:32
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张宏宇123

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-04-26 16:03:03
你的对照菌株确定是没有卡纳抗性的吗？
同源交换错误也肯定有完整基因的片段，不能扩增不出来啊？
你确定一下看看你的打靶片段是不是正确，测序是否正确。
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未来不是梦
2楼2012-04-25 22:45:27
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thestormcong

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 张宏宇123 at 2012-04-25 22:45:27:
你的对照菌株确定是没有卡纳抗性的吗？
同源交换错误也肯定有完整基因的片段，不能扩增不出来啊？
你确定一下看看你的打靶片段是不是正确，测序是否正确。

恩，谢谢你的意见。我的原始株是没有卡纳抗性的，这个是肯定的。我的打靶片断也是用保真性高的酶跑的，应该不会错吧，测序是没有测过的。
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3楼2012-04-25 23:18:54
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fwks3518

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-04-27 13:39:39
煮菌时间要足够长，你最好用野生型菌株一起煮，做个阳性对照。这样才好解释。
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4楼2012-04-26 08:44:38
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