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thestormcong银虫 (小有名气)
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red基因敲除
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大家好，最近做red基因敲除，遇到困难，特地请求高人指点。 我将带有同源臂的打靶片段电转化入宿主细胞中，筛选转化子（我用的是卡纳抗性）。对转化子进行菌落pcr，菌落pcr的引物设计在待敲除基因的上下游。我挑了6个转化子，也做了阳性对照（原始株）。结果是有一个有条带，大小跟野生株的一样。另外5个都没有条带。我很纳闷！理论上来说的话应该都能扩增出条带，只是大小不同，可是为什么我有5个都没有能够扩增出条带呢？ 自己也分析了一下原因。 1：有可能是其他带有卡纳抗性的菌株的污染。可是我对这些菌株的别的基因进 行过菌落pcr（实验室有做该细菌别的基因），都是有条带的，表明这些还是我的菌株。 2：会不会是里面的同源交换出错了呢？但是细菌还是有卡纳抗性的。也对这个细菌提过质粒，没有发现质粒条带。 3：菌落pcr的问题吗？可是每一次的阳性对照都很正常啊。 综上所述，希望得到有经验的虫友的帮助，万分感谢！！！！！！！！ |
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