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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 载体构建，测序结果显示目的基因全突变，克隆入T载体，菌液PCR全是假阳性
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liuwhlong

铁虫 (初入文坛)

[求助] 载体构建，测序结果显示目的基因全突变，克隆入T载体，菌液PCR全是假阳性已有5人参与

各位前辈好，本人研一，进入实验室将近一年，最近构建真核表达载体5个，从细胞内trizol法提取总RNA，反转录产物作为模板，用5队特异性引物均能扩出目的片段，胶回收，回收产物琼脂糖电泳检测，双酶切，连接20小时，转化，挑菌各12个，于1.5ml EP管内加入500ul LB，摇混，行菌液PCR，电泳结果均为引物二聚体，反复做了多次，都是这样，第四次的时候出了几个阳性的，测序又显示全突变，，目的基因大小700多bp，PCR用的是艾德莱的 MIX，最后用LA酶扩，测序仍然有突变，关键是，模板是细胞内提取的RNA反转录得到的，怎么会有突变？求指点，谢谢
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1楼2014-04-30 23:53:08
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

BioChen

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
liuwhlong(myprayer代发): 金币+2, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-05-01 20:45:01
全突变是什么意思？是根本不是你想要的基因，还是突变率很高？
如果不是你要想要的基因，
cDNA的PCR产物后直接送去测序，如果是你想要的基因，继续往下做。如果不是你想要的基因，请分析PCR产物序列，找出错配的原因，重新设计引物，避开错配。还有就是你选对了细胞系了吗？cDNA是有组织特异性的。建议你用Expression Atlas（http://www.ebi.ac.uk/gxa/home）去分析下你的基因在哪些细胞系里面表达相对高，具体方法自己去看xpression Atlas官方的帮助文档，不难。

如果是突变率很高，
PCR实验过程中产生的突变率是相当低的，楼上说了，可以换高保真酶，如果换酶注意这个酶能否产生A末端，KOD酶不能产生A末端，不能直接连T载体的。
还有基因有很多variant（变异体），还有可能有不同的transcript（转录本）。它们之间去比较的话，很显然你会得出突变很多的结论。

检测是否连接正确，我有一个简单的方法，比菌落PCR、提取质粒后酶切快捷，经济：
1、挑菌后，摇4h-6h
2、80ul菌液+20ul苯酚（可以自己配置细菌裂解液，我比较懒，直接用苯酚了）+20ul 6x loading buffer
3、震荡后离心，取20ul上清电泳，同时点空质粒做对照。
如果有插入片段的话，会有比空质粒慢一点点的条带。插入片段在500以上，基本上能分清。
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5楼2014-05-01 20:43:14
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lim1896

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
gyesang: 金币+4, 鼓励交流！ 2014-05-04 14:31:49
首先确定是出现两个问题，一个是P不出来，全是二聚体；在一个就是测序发现不是目的片段
问题回答1：出现引物二聚体的原因有很多，有可能是引物浓度太高，一般用0.5um的浓度就够了（50ul体系里加1ul 10um浓度的引物），还有可能是是退火温度太高，试试降低退火温度的效果，再一个就是没有模板。
2、出现测序结果不是目的片段的可能原因，要么就是测序是反向测的，你比对的时候没有把序列反义过来比对，所以比对的结果全是反的，也就是完全对不上号。再或者测序的结果是载体本身的片段，并不是你的目的片段，所以，选择测序引物的时候也要注意用合适的，如果测序引物对于载体的来讲本身就可以P出来几百的片段，那可能你的目的片段根本就没有练上去,P出来的几百的片段实际是载体上的片段
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9楼2014-05-04 10:48:05
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zep616745243

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
liuwhlong(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-05-01 20:44:42
700bp目的片段不算大，不知道你的全突变是什么意思，是保真性太差还是非目的片段，cDNA没问题的话，建议考虑下rna模板本身的问题

[ 发自小木虫客户端 ]
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只有不断地失败才会成功
2楼2014-05-01 00:30:48
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-05-01 22:32:25
实在不行   就买那种高保真的酶试试   比如KOD   还有一个P开头的
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3楼2014-05-01 09:38:55
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liuderong

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
liuwhlong(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-05-01 20:44:50
一般情况下700bp的序列很少突变的，你的突变几率这么高，可能是实验出了问题。另一种情况是基因确实因为某种原因突变了，要是这种突变还有某种表型，那就好好好分析一下，大文章就是这么发出来的！
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4楼2014-05-01 11:25:26
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DoRbIr

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-05-01 09:38:55
实在不行   就买那种高保真的酶试试   比如KOD   还有一个P开头的

Pfu？
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6楼2014-05-02 20:30:07
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393658000

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-05-03 20:33:19
第一点，不明白你说的全突变是什么意思，是突变了一个碱基？还是说插入的片段根本就不是你想要的；
第二点，其实你用到的2个酶应该都是Taq类型的，LA别以为是个好东西，你在扩增长片段时有时候确实是能够PCR出来，但是保真就一般般了，所以我从来不用这些玩意，除了他们的BUFF；
第三点，突变不一定就是PCR产生的，因为有可能你的模板就已经是突变了，你说的突变肯定是跟你想要的标准序列有出入，没准会是SNP
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7楼2014-05-03 13:47:58
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by DoRbIr at 2014-05-02 20:30:07
Pfu？...

好像是的
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8楼2014-05-03 23:12:59
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liuwhlong

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zep616745243 at 2014-05-01 00:30:48
700bp目的片段不算大，不知道你的全突变是什么意思，是保真性太差还是非目的片段，cDNA没问题的话，建议考虑下rna模板本身的问题

全突变就是，送去测序的样本都有碱基缺失，并且有点突变
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10楼2014-05-21 22:34:48
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