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liuwhlong

铁虫 (初入文坛)

[求助] 载体构建,测序结果显示目的基因全突变,克隆入T载体,菌液PCR全是假阳性 已有5人参与

各位前辈好,本人研一,进入实验室将近一年,最近构建真核表达载体5个,从细胞内trizol法提取总RNA,反转录产物作为模板,用5队特异性引物均能扩出目的片段,胶回收,回收产物琼脂糖电泳检测,双酶切,连接20小时,转化,挑菌各12个,于1.5ml EP管内加入500ul LB,摇混,行菌液PCR,电泳结果均为引物二聚体,反复做了多次,都是这样,第四次的时候出了几个阳性的,测序又显示全突变,,目的基因大小700多bp,PCR用的是艾德莱的 MIX,最后用LA酶扩,测序仍然有突变,关键是,模板是细胞内提取的RNA反转录得到的,怎么会有突变?求指点,谢谢
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liuwhlong

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by zep616745243 at 2014-05-01 00:30:48
700bp目的片段不算大,不知道你的全突变是什么意思,是保真性太差还是非目的片段,cDNA没问题的话,建议考虑下rna模板本身的问题

全突变就是,送去测序的样本都有碱基缺失,并且有点突变
10楼2014-05-21 22:34:48
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zep616745243

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
liuwhlong(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-05-01 20:44:42
700bp目的片段不算大,不知道你的全突变是什么意思,是保真性太差还是非目的片段,cDNA没问题的话,建议考虑下rna模板本身的问题

[ 发自小木虫客户端 ]
只有不断地失败才会成功
2楼2014-05-01 00:30:48
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2014-05-01 22:32:25
实在不行   就买那种高保真的酶试试   比如KOD   还有一个P开头的
3楼2014-05-01 09:38:55
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liuderong

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
liuwhlong(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-05-01 20:44:50
一般情况下700bp的序列很少突变的,你的突变几率这么高,可能是实验出了问题。另一种情况是基因确实因为某种原因突变了,要是这种突变还有某种表型,那就好好好分析一下,大文章就是这么发出来的!
4楼2014-05-01 11:25:26
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