| 查看: 3827 | 回复: 11 | ||||
[求助]
载体构建，测序结果显示目的基因全突变，克隆入T载体，菌液PCR全是假阳性 已有5人参与
|
||||
| 各位前辈好，本人研一，进入实验室将近一年，最近构建真核表达载体5个，从细胞内trizol法提取总RNA，反转录产物作为模板，用5队特异性引物均能扩出目的片段，胶回收，回收产物琼脂糖电泳检测，双酶切，连接20小时，转化，挑菌各12个，于1.5ml EP管内加入500ul LB，摇混，行菌液PCR，电泳结果均为引物二聚体，反复做了多次，都是这样，第四次的时候出了几个阳性的，测序又显示全突变，，目的基因大小700多bp，PCR用的是艾德莱的 MIX，最后用LA酶扩，测序仍然有突变，关键是，模板是细胞内提取的RNA反转录得到的，怎么会有突变？求指点，谢谢 |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 分子生化实验经验积累 |
» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有187人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
-
留学--博士招生
已经有16人回复
-
化学工程，本211，求调剂，ab区不限
已经有4人回复
-
邵阳学院食品与化学工程学院硕士调剂
已经有0人回复
-
湖北师范大学招调剂啦
已经有4人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 用pMD 19-T做克隆之后用哪对通用引物做菌落PCR以及测序呢？
已经有7人回复
- 克隆基因，用PMD19-T载体转天根的感受态细胞，菌落少，测的序列全是空载体，求原因·
已经有21人回复
- 目的基因连接到克隆载体后提取质粒测序，序列有问题
已经有11人回复
- 有用同源重组法进行基因克隆和载体构建的吗？
已经有8人回复
- 做单克隆测序是菌液好还是菌液PCR后测好?
已经有9人回复
- 挑单克隆后，菌液PCR检测所有条带都偏小，目的条带没有出现
已经有9人回复
- 我做TA克隆，准备拿序列去测序。做完转化以后直接做个菌液PCR检验一下是否有目的
已经有31人回复
- TA克隆，但是PCR的片段几十bp，最好选用什么T载体呢？
已经有7人回复
- 已知全长基因怎样克隆并构建表达载体
已经有8人回复
- 【求助】基因克隆T载体酶切问题等
已经有8人回复
- 已知基因全长，克隆构建表达载体
已经有5人回复
- 克隆基因连接到载体上测序发现有一个点突变怎么办？
已经有16人回复
- 克隆基因和载体连接后转化至大肠杆菌，为什么每次涂板都是空平板没有菌落？
已经有17人回复
- 【求助/交流】核基因 PCR产物直接测序，结果出现单个位点套峰，是否需要做克隆测序
已经有9人回复
【答案】应助回帖
★ ★
感谢参与，应助指数 +1
liuwhlong(myprayer代发): 金币+2, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-05-01 20:45:01
感谢参与，应助指数 +1
liuwhlong(myprayer代发): 金币+2, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-05-01 20:45:01
|
全突变是什么意思？是根本不是你想要的基因，还是突变率很高？ 如果不是你要想要的基因， cDNA的PCR产物后直接送去测序，如果是你想要的基因，继续往下做。如果不是你想要的基因，请分析PCR产物序列，找出错配的原因，重新设计引物，避开错配。还有就是你选对了细胞系了吗？cDNA是有组织特异性的。建议你用Expression Atlas（http://www.ebi.ac.uk/gxa/home）去分析下你的基因在哪些细胞系里面表达相对高，具体方法自己去看xpression Atlas官方的帮助文档，不难。 如果是突变率很高， PCR实验过程中产生的突变率是相当低的，楼上说了，可以换高保真酶，如果换酶注意这个酶能否产生A末端，KOD酶不能产生A末端，不能直接连T载体的。 还有基因有很多variant（变异体），还有可能有不同的transcript（转录本）。它们之间去比较的话，很显然你会得出突变很多的结论。 检测是否连接正确，我有一个简单的方法，比菌落PCR、提取质粒后酶切快捷，经济： 1、挑菌后，摇4h-6h 2、80ul菌液+20ul苯酚（可以自己配置细菌裂解液，我比较懒，直接用苯酚了）+20ul 6x loading buffer 3、震荡后离心，取20ul上清电泳，同时点空质粒做对照。 如果有插入片段的话，会有比空质粒慢一点点的条带。插入片段在500以上，基本上能分清。 |
5楼2014-05-01 20:43:14
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★
gyesang: 金币+4, 鼓励交流！ 2014-05-04 14:31:49
gyesang: 金币+4, 鼓励交流！ 2014-05-04 14:31:49
|
首先确定是出现两个问题，一个是P不出来，全是二聚体；在一个就是测序发现不是目的片段 问题回答1：出现引物二聚体的原因有很多，有可能是引物浓度太高，一般用0.5um的浓度就够了（50ul体系里加1ul 10um浓度的引物），还有可能是是退火温度太高，试试降低退火温度的效果，再一个就是没有模板。 2、出现测序结果不是目的片段的可能原因，要么就是测序是反向测的，你比对的时候没有把序列反义过来比对，所以比对的结果全是反的，也就是完全对不上号。再或者测序的结果是载体本身的片段，并不是你的目的片段，所以，选择测序引物的时候也要注意用合适的，如果测序引物对于载体的来讲本身就可以P出来几百的片段，那可能你的目的片段根本就没有练上去,P出来的几百的片段实际是载体上的片段 |
9楼2014-05-04 10:48:05
zep616745243
银虫 (小有名气)
- 应助: 32 (小学生)
- 金币: 320.5
- 散金: 20
- 红花: 1
- 帖子: 210
- 在线: 70.8小时
- 虫号: 1120444
- 注册: 2010-10-12
- 性别: GG
- 专业: 兽医传染病学
2楼2014-05-01 00:30:48
鬼羽帝魂
木虫 (著名写手)
- 应助: 183 (高中生)
- 金币: 3100.2
- 散金: 19
- 红花: 12
- 帖子: 1427
- 在线: 186.8小时
- 虫号: 2538789
- 注册: 2013-07-09
- 专业: 生物物理、生物化学与分子
3楼2014-05-01 09:38:55
liuderong
铁杆木虫 (正式写手)
- 应助: 310 (大学生)
- 金币: 8202.1
- 红花: 31
- 帖子: 582
- 在线: 142.1小时
- 虫号: 1882145
- 注册: 2012-07-07
- 性别: GG
- 专业: 生物化学
4楼2014-05-01 11:25:26
DoRbIr
金虫 (正式写手)
- 应助: 23 (小学生)
- 金币: 1525.6
- 红花: 3
- 帖子: 686
- 在线: 750.2小时
- 虫号: 875515
- 注册: 2009-10-17
- 性别: GG
- 专业: 微生物生态学
6楼2014-05-02 20:30:07
7楼2014-05-03 13:47:58
鬼羽帝魂
木虫 (著名写手)
- 应助: 183 (高中生)
- 金币: 3100.2
- 散金: 19
- 红花: 12
- 帖子: 1427
- 在线: 186.8小时
- 虫号: 2538789
- 注册: 2013-07-09
- 专业: 生物物理、生物化学与分子
8楼2014-05-03 23:12:59
10楼2014-05-21 22:34:48
10