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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 载体构建，测序结果显示目的基因全突变，克隆入T载体，菌液PCR全是假阳性
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liuwhlong

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by BioChen at 2014-05-01 20:43:14
全突变是什么意思？是根本不是你想要的基因，还是突变率很高？
如果不是你要想要的基因，
cDNA的PCR产物后直接送去测序，如果是你想要的基因，继续往下做。如果不是你想要的基因，请分析PCR产物序列，找出错配的原 ...

多谢，试了你的方法，效果明显，重新用LA高保真酶扩了一次，这次全扩出来了，测序结果也正确，十分感谢提供宝贵的建议！
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11楼2014-05-21 22:38:30
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liuwhlong

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by lim1896 at 2014-05-04 10:48:05
首先确定是出现两个问题，一个是P不出来，全是二聚体；在一个就是测序发现不是目的片段
问题回答1：出现引物二聚体的原因有很多，有可能是引物浓度太高，一般用0.5um的浓度就够了（50ul体系里加1ul 10um浓度的引物 ...

不好意思是我表述的不清楚，是送去测序的时候，目的基因序列有碱基缺失，还有点突变，换了LA酶，重提RNA后，问题解决了，谢谢指点，不胜感激
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12楼2014-05-21 22:47:55
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