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liuwhlong

铁虫 (初入文坛)

应助: 1 (幼儿园)
金币: 16.4
散金: 20
红花: 1
帖子: 26
在线: 7.4小时
虫号: 2645019
注册: 2013-09-10
专业: 口腔颌面疾病其他科学问题

[求助] 载体构建，测序结果显示目的基因全突变，克隆入T载体，菌液PCR全是假阳性已有5人参与

各位前辈好，本人研一，进入实验室将近一年，最近构建真核表达载体5个，从细胞内trizol法提取总RNA，反转录产物作为模板，用5队特异性引物均能扩出目的片段，胶回收，回收产物琼脂糖电泳检测，双酶切，连接20小时，转化，挑菌各12个，于1.5ml EP管内加入500ul LB，摇混，行菌液PCR，电泳结果均为引物二聚体，反复做了多次，都是这样，第四次的时候出了几个阳性的，测序又显示全突变，，目的基因大小700多bp，PCR用的是艾德莱的 MIX，最后用LA酶扩，测序仍然有突变，关键是，模板是细胞内提取的RNA反转录得到的，怎么会有突变？求指点，谢谢

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1楼2014-04-30 23:53:08

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liuderong

铁杆木虫 (正式写手)

应助: 310 (大学生)
金币: 8202.1
红花: 31
帖子: 582
在线: 142.1小时
虫号: 1882145
注册: 2012-07-07
性别: GG
专业: 生物化学

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
liuwhlong(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-05-01 20:44:50

一般情况下700bp的序列很少突变的，你的突变几率这么高，可能是实验出了问题。另一种情况是基因确实因为某种原因突变了，要是这种突变还有某种表型，那就好好好分析一下，大文章就是这么发出来的！

4楼2014-05-01 11:25:26

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