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hellohuo

金虫 (小有名气)

[求助] 克隆基因，用PMD19-T载体转天根的感受态细胞，菌落少，测的序列全是空载体，求原因· 已有1人参与

克隆基因，用PMD19-T载体，天根的感受态细胞，进行转化，可是涂板之后，菌落少，测的序列全是空载体，求教：会是哪些原因导致的？我的目的基因片段大概3-4K左右，是不是和片段大小有关？
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1楼 2013-06-19 15:39:50
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hellohuo

金虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by 山毛榉树 at 2013-10-13 14:57:34
现在这个问题你解决了么，我也遇到了类似的问题，好伤心。。。...

没有，估计还是和做实验的经验有关吧，我的师姐做就没啥问题，你可以找个师兄师姐一起做，看看，如果结果差不多，那么就要看是不是感受态的问题。还有一个原因就可能是抗生素的量多少的问题~
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16楼2013-10-14 17:17:39
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zhoulubin

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
hellohuo(myprayer代发): 金币+1, Gifts of roses, hand there are lingering fragrance. Look forward to your wonderful and more detailed answer. 2013-06-19 17:07:53
3~4K是有点大，最好是16℃过夜。
做蓝白筛选，减少假阳性。
感受态也会有影响，可以做一个阳性对照。
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每个年龄都有其最应该做的事，但只有过了那个年龄自己才知道
2楼2013-06-19 16:06:17
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hellohuo

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhoulubin at 2013-06-19 16:06:17
3~4K是有点大，最好是16℃过夜。
做蓝白筛选，减少假阳性。
感受态也会有影响，可以做一个阳性对照。

感受态也会有影响吗？还有一个问题，就是如果抗生素加的会多一些，对菌落的形成是不是也有一定的影响？
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3楼2013-06-19 16:58:47
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dcb005

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, Gifts of roses, hand there are lingering fragrance. Look forward to your wonderful and more detailed answer. 2013-06-19 17:08:02
你的Taq酶是什么牌子，p产物有A 尾巴吗？
还有就是检查你的T4酶，是否活性足够高。
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★穷则独善其身,达则兼济天下★
4楼2013-06-19 17:03:22
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dcb005

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
hellohuo(myprayer代发): 金币+1, Gifts of roses, hand there are lingering fragrance. Look forward to your wonderful and more detailed answer. 2013-06-19 17:08:13
为什么不做个Colony PCR，就直接测序，这样浪费时间精力的，我一般先做个PCR看看的，有条带再测序
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★穷则独善其身,达则兼济天下★
5楼2013-06-19 17:04:44
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zhoulubin

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-06-19 21:36:24
引用回帖:
3楼: Originally posted by hellohuo at 2013-06-19 16:58:47
感受态也会有影响吗？还有一个问题，就是如果抗生素加的会多一些，对菌落的形成是不是也有一定的影响？...

如果感受态转化效率不行，肯定长出的单菌落就少。但买的感受态应该都问题不大，我们都是自己做的。
TA克隆Amp抗性我们一般用的是100mg/l，理论上只要多加的不多，影响也应该不大。
还有就是4楼提到的Taq酶，很多高保真的Taq酶不能在3‘末端加A，这样你就得自己加，具体方法你可以再网上找找，或者买个加A kit。
顺带说一下，如果你做TA克隆是为了下一步其他载体构建，建议不用做TA克隆，直接对PCR产物进行酶切，然后连接到载体上，当然，这中间有很多纯化的步骤。
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每个年龄都有其最应该做的事，但只有过了那个年龄自己才知道
6楼2013-06-19 20:47:19
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wchuangqi

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-06-26 12:37:02
做完连接以后没有鉴定就去测序了？
一般会选择下面任何或者同时的方法去鉴定，然后再送去测序：
1. 菌落PCR
2.提质粒，做酶切
一般推荐第一种吧。确定你的片段在载体上以后再去测序。
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天道酬勤
7楼2013-06-21 09:13:01
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hellohuo

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by dcb005 at 2013-06-19 17:03:22
你的Taq酶是什么牌子，p产物有A 尾巴吗？
还有就是检查你的T4酶，是否活性足够高。

是TAKARA的HS高保真酶，后来我又用普通的Taq酶加尾，回收之后涂板没长出菌落······
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8楼2013-06-21 09:25:17
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hellohuo

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by zhoulubin at 2013-06-19 20:47:19
如果感受态转化效率不行，肯定长出的单菌落就少。但买的感受态应该都问题不大，我们都是自己做的。
TA克隆Amp抗性我们一般用的是100mg/l，理论上只要多加的不多，影响也应该不大。
还有就是4楼提到的Taq酶，很多 ...

嗯，我用普通的Taq酶加尾，可是回收纯化之后，再连接，涂板，就没有长出菌落，或者只有一两个斑，是不是连接的问题？还是和我的片段太大有关系？
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9楼2013-06-21 09:29:33
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hellohuo

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by wchuangqi at 2013-06-21 09:13:01
做完连接以后没有鉴定就去测序了？
一般会选择下面任何或者同时的方法去鉴定，然后再送去测序：
1. 菌落PCR
2.提质粒，做酶切
一般推荐第一种吧。确定你的片段在载体上以后再去测序。

做过菌落PCR，看到有条带，然后送去测序，结果都是空载体。估计是因为载体自连之后的片段大小和我的目的基因的大小差不多吧···所以我在纠结究竟是哪里出了问题~
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10楼2013-06-21 09:33:15
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