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hellohuo

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[求助] 克隆基因，用PMD19-T载体转天根的感受态细胞，菌落少，测的序列全是空载体，求原因· 已有1人参与

克隆基因，用PMD19-T载体，天根的感受态细胞，进行转化，可是涂板之后，菌落少，测的序列全是空载体，求教：会是哪些原因导致的？我的目的基因片段大概3-4K左右，是不是和片段大小有关？

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1楼 2013-06-19 15:39:50

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hellohuo

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6楼: Originally posted by zhoulubin at 2013-06-19 20:47:19
如果感受态转化效率不行，肯定长出的单菌落就少。但买的感受态应该都问题不大，我们都是自己做的。
TA克隆Amp抗性我们一般用的是100mg/l，理论上只要多加的不多，影响也应该不大。
还有就是4楼提到的Taq酶，很多 ...

嗯，我用普通的Taq酶加尾，可是回收纯化之后，再连接，涂板，就没有长出菌落，或者只有一两个斑，是不是连接的问题？还是和我的片段太大有关系？

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9楼2013-06-21 09:29:33

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zhoulubin

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hellohuo(myprayer代发): 金币+1, Gifts of roses, hand there are lingering fragrance. Look forward to your wonderful and more detailed answer. 2013-06-19 17:07:53

3~4K是有点大，最好是16℃过夜。
做蓝白筛选，减少假阳性。
感受态也会有影响，可以做一个阳性对照。

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每个年龄都有其最应该做的事，但只有过了那个年龄自己才知道

2楼2013-06-19 16:06:17

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hellohuo

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引用回帖:

2楼: Originally posted by zhoulubin at 2013-06-19 16:06:17
3~4K是有点大，最好是16℃过夜。
做蓝白筛选，减少假阳性。
感受态也会有影响，可以做一个阳性对照。

感受态也会有影响吗？还有一个问题，就是如果抗生素加的会多一些，对菌落的形成是不是也有一定的影响？

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3楼2013-06-19 16:58:47

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dcb005

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myprayer: 金币+1, Gifts of roses, hand there are lingering fragrance. Look forward to your wonderful and more detailed answer. 2013-06-19 17:08:02

你的Taq酶是什么牌子，p产物有A 尾巴吗？
还有就是检查你的T4酶，是否活性足够高。

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★穷则独善其身,达则兼济天下★

4楼2013-06-19 17:03:22

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