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xjj5287

铁虫 (初入文坛)

[求助] 基因克隆问题~~

请教：一段目的基因克隆于pGEM-T easy  vector  后，经测序具有claI和xbaI酶切位点，但是进行酶切时不能切开得到目的基因，这是怎么回事？谢谢。。。
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1楼 2011-05-11 10:12:13
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xiajungang

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): good 2011-05-11 13:46:23
先保证你的限制酶没问题，然后就是考虑重组子在宿主菌里是不是被甲基化了？试试甲基化酶基因缺失的宿主菌
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吃苦耐劳，勇于创新，乐观热情，积极向上！
2楼2011-05-11 13:09:07
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空谷幽风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
Originally posted by xjj5287 at 2011-05-11 10:12:13:
请教：一段目的基因克隆于pGEM-T easy  vector  后，经测序具有claI和xbaI酶切位点，但是进行酶切时不能切开得到目的基因，这是怎么回事？谢谢。。。

不知道你用的什么感受态细胞，如果是top10的话是XbaI是很容易被甲基化的，你可以先通过pcr扩增验证是否含有目的片段，然后转化JM110感受态细胞后提质粒酶切得到目的基因
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a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
3楼2011-05-11 14:28:10
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xjj5287

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 空谷幽风 at 2011-05-11 14:28:10:
不知道你用的什么感受态细胞，如果是top10的话是XbaI是很容易被甲基化的，你可以先通过pcr扩增验证是否含有目的片段，然后转化JM110感受态细胞后提质粒酶切得到目的基因

PCR有目的片段，测序也是对的，用的是DH5A感受态，如果是被甲基化了，应该怎么办啊？
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4楼2011-05-11 16:42:02
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dhd997(金币+3, EPI+1): 2011-05-11 17:03:19
1:测序结果是否可靠？这两个酶切位点是只有一个吗？
2：双酶切是否完全？酶切体系和时间都会影响你的酶切效果；
3：能不能直接上图，是压根没有切动还是酶切不完全？
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
5楼2011-05-11 16:49:06
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xjj5287

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-05-11 16:49:06:
1:测序结果是否可靠？这两个酶切位点是只有一个吗？
2：双酶切是否完全？酶切体系和时间都会影响你的酶切效果；
3：能不能直接上图，是压根没有切动还是酶切不完全？

3Q.问题已经解决了，重新设计了PRMIER,最后切开了
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6楼2011-05-22 17:11:13
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