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xjj5287

铁虫 (初入文坛)

[求助] 基因克隆问题~~

请教:一段目的基因克隆于pGEM-T easy  vector  后,经测序具有claI和xbaI酶切位点,但是进行酶切时不能切开得到目的基因,这是怎么回事?谢谢。。。
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xiajungang

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): good 2011-05-11 13:46:23
先保证你的限制酶没问题,然后就是考虑重组子在宿主菌里是不是被甲基化了?试试甲基化酶基因缺失的宿主菌
吃苦耐劳,勇于创新,乐观热情,积极向上!
2楼2011-05-11 13:09:07
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空谷幽风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
Originally posted by xjj5287 at 2011-05-11 10:12:13:
请教:一段目的基因克隆于pGEM-T easy  vector  后,经测序具有claI和xbaI酶切位点,但是进行酶切时不能切开得到目的基因,这是怎么回事?谢谢。。。

不知道你用的什么感受态细胞,如果是top10的话是XbaI是很容易被甲基化的,你可以先通过pcr扩增验证是否含有目的片段,然后转化JM110感受态细胞后提质粒酶切得到目的基因
a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
3楼2011-05-11 14:28:10
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xjj5287

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
Originally posted by 空谷幽风 at 2011-05-11 14:28:10:
不知道你用的什么感受态细胞,如果是top10的话是XbaI是很容易被甲基化的,你可以先通过pcr扩增验证是否含有目的片段,然后转化JM110感受态细胞后提质粒酶切得到目的基因

PCR有目的片段,测序也是对的,用的是DH5A感受态,如果是被甲基化了,应该怎么办啊?
4楼2011-05-11 16:42:02
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dhd997(金币+3, EPI+1): 2011-05-11 17:03:19
1:测序结果是否可靠?这两个酶切位点是只有一个吗?
2:双酶切是否完全?酶切体系和时间都会影响你的酶切效果;
3:能不能直接上图,是压根没有切动还是酶切不完全?
Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
5楼2011-05-11 16:49:06
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xjj5287

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-05-11 16:49:06:
1:测序结果是否可靠?这两个酶切位点是只有一个吗?
2:双酶切是否完全?酶切体系和时间都会影响你的酶切效果;
3:能不能直接上图,是压根没有切动还是酶切不完全?

3Q.问题已经解决了,重新设计了PRMIER,最后切开了
6楼2011-05-22 17:11:13
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