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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】基因克隆实验为非目的片段？
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zhangwuhui

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】基因克隆实验为非目的片段？已有16人参与

克隆实验问题
1、以cDNA为模板做PCR反应，得到的产物和预期的长度一样。
2、再用pMD-19载体连接目的片段，之后液体LB（含氨苄）200转震荡培养1-2小时，取300微升倒在LB平板培养24小时左右，以阳性菌落长到直径1-2毫米为止；再挑3-5个阳性单克隆放大培养24小时左右。
3、裂解菌体，4°C ，12 000 g ，离心20-30分钟，得到质粒。
4、PCR检测所得质粒（引物为M13-47, RV-M），得到了目的片段大小的产物（稍长些）。
5、送质粒测序（使用通用引物M13-47），但是测序结果却是如下其概况：在载体插入点之间的序列BLAST后，显示为杆菌等细菌的片段，共送了10个样品均是如此（本实验应该是动物的序列），看来不是空载，难道是载体连接上了细菌的一段序列，为什么会插入细菌片段呢，而且长度就这么巧！还是其他什么原因呢，恳请赐教！

[ Last edited by zhangwuhui on 2010-7-29 at 18:31 ]
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1楼2010-07-25 20:23:31
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

stephenreal

至尊木虫 (著名写手)

别忘了对照

★ ★ ★
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reasonspare(金币+2):谢谢分享。 2010-08-03 05:50:12
千万别图省事，在转化时按照分子克隆的要求，加上载体对照、阴性对照（以LB或者SOB代替克隆基因）或无关对照（其它基因片段），这样应该能查出原因。而一般人做的时候，就只转1个阳性的。与其碰运气，还不如严格一点。如果载体对照甚或阴性对照也出现你描述的现象，才可以说是污染，不要乱猜，反而费时间。
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7楼2010-07-27 11:11:14
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普通回帖

sunyongle1

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
样品是不是有污染了？比如就是杆菌的污染。
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2楼2010-07-25 21:02:34
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jhon86

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
也许是载体发生自连接……或许是细菌之间发生质粒接合转移作用！
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3楼2010-07-25 23:03:21
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
★ ★ ★
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scelab(金币+2):谢谢交流 2010-10-22 21:48:15
我想知道楼主做的是什么基因，在杆菌中存在吗？
感觉你不是测序有问题，就是blast的序列不对，你的克隆应该是阳性的

建议你做PCR时，做阴性对照看一下
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4楼2010-07-25 23:28:53
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zhangwuhui

铜虫 (小有名气)
感谢你的关注和解答！我按照你的建议试试！
引用回帖:
Originally posted by yujiaping1 at 2010-07-25 23:28:53:
我想知道楼主做的是什么基因，在杆菌中存在吗？
感觉你不是测序有问题，就是blast的序列不对，你的克隆应该是阳性的

建议你做PCR时，做阴性对照看一下

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5楼2010-07-26 19:30:01
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canon-ph

铜虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
测序时的菌污染了吧 一般后面验证时大小不对 测序就不对了 重新做 小心污染  就好了
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6楼2010-07-27 11:00:13
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zhangwuhui

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by stephenreal at 2010-07-27 11:11:14:
千万别图省事，在转化时按照分子克隆的要求，加上载体对照、阴性对照（以LB或者SOB代替克隆基因）或无关对照（其它基因片段），这样应该能查出原因。而一般人做的时候，就只转1个阳性的。与其碰运气，还不如严格一 ...

感谢提的建议！谢谢！
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8楼2010-07-27 13:46:13
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zhouhuaxi

铜虫 (正式写手)
两种情况，CDNA污染，还有就是细菌污染所致。
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9楼2010-07-27 15:53:42
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毛毛2802

新虫 (初入文坛)
★ ★
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reasonspare(金币+1):谢谢交流 2010-08-03 05:50:41
请问一下楼主，我看到你的提取质粒的步骤十分简单啊，“裂解菌体，4°C ，12 000 g ，离心20-30分钟，得到质粒”，我想问一下你加的裂解液是什么啊，然后加完就真的离心半小时就得到质粒了吗？纯度如何啊，不会有蛋白其他的污染吗？做后续的PCR和酶切都没有问题吗？
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10楼2010-08-02 23:14:28
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