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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助！大片段4kb左右基因PCR克隆方法
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angelee

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助！大片段4kb左右基因PCR克隆方法 已有2人参与

求助！大片段4kb左右基因PCR克隆方法。之前，设计引物以cDNA为模板扩增，结果没有任何条带，究竟是为什么呢？求解答~
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1楼 2011-12-09 21:45:08
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

3kd-20kd的DNA片段适用长片段PCR扩增。

长片段PCR不同于一般PCR的特殊要求

1.用Taq-LA DNA聚合酶，该酶是Taq酶或Klentaq 1（无纠错功能）与pfu酶或Deep Vent酶（有纠错功能）的混合物，以Taq酶为主。
2.当需要扩增的片段大于20kd时，需要加入高浓度的甜茶碱（终浓度为1.5-2.0mol/L)，提高PCR的效率，但是甜茶碱加入后，要将扩增反应的温度降低2-3度。楼主的扩增片段还到不了20kd,甜茶碱可以少加点。
3.适当升高镁离子浓度，不要太高了镁离子浓度高于底物dNTP浓度即可。
4.变性时间要短，尤其是一般不超过30 s，尤其是模板长度超过8KD时更是如此，变性时间长会破坏模板。
5.延伸温度可以下降为68摄氏度，同时加长延伸反应时间，长度为3-5kd的模板延伸反应时间为5-10分钟，长度为20-35kd的模板延伸反应时间为20分钟，楼主的PCR的延伸反应时间可能为12-16分钟左右。
6.模板浓度最好在1ng/L以内。
7.应用长片段PCR缓冲溶液。10X长片段PCR缓冲溶液组成为：500 mmol/L Tris-Cl(pH=9.0),160 mmol/L硫酸铵，25 mmol/L MgCl2,1.5mmol/L BSA。
8.设计较长的PCR引物（25-30 bp)
其他同普通PCR。
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12楼2014-07-11 10:46:19
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mimi糖砣

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cxl_yll at 2011-12-10 10:34:26
用takara的la taq酶，我9000都出来了，不过概率很小

想请教一下，我最近想克隆七八千左右的，用cDNA克隆，请问能不能指点一些细节，比如反转录什么酶比较好，有没有检测cDNA的质量，引物设计需要注意什么，有没有分段克隆的经验？问题比较多，非常感谢分享~
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10楼2014-07-10 14:08:04
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cxl_yll

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
10楼: Originally posted by mimi糖砣 at 2014-07-10 14:08:04
想请教一下，我最近想克隆七八千左右的，用cDNA克隆，请问能不能指点一些细节，比如反转录什么酶比较好，有没有检测cDNA的质量，引物设计需要注意什么，有没有分段克隆的经验？问题比较多，非常感谢分享~...

我用的LA tag预混装的，P了1个月，就P出5次，你可能需要换一种方法，基本做一次PCR需要10个小时吧，3年前做的细节忘记的差不多了，我给你回信了...
分段克隆需要找到合适的酶切位点吧，一般好的酶切位点都没占用了，还有链接的时候有时候需要看一下方向...
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11楼2014-07-11 10:03:43
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普通回帖

shaquila

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

大片段的反转是个问题哦
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2楼2011-12-10 07:49:21
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zhaoyonggang

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
lstt09nk(金币+2): 鼓励交流 2011-12-10 10:56:18
先看看引物设计问题，Tm是不是太低了，有没有引物二聚体。

如果引物设计没有问题的话，看看cDNA序列中有没有高GC含量的片段等difficult 序列。有得话，试试two-step PCR，或者加点DMSO或甜菜碱。去网上google一下吧，会有有用的信息的。

4Kb不算太大，应该是没问题的。
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3楼2011-12-10 10:03:06
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cxl_yll

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
lstt09nk(金币+1): 9000哦，很厉害哦 2011-12-10 10:56:37
用takara的la taq酶，我9000都出来了，不过概率很小
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4楼2011-12-10 10:34:26
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lihegang2000

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

takara的LA-taq酶可以试试，也可以分两段或者三段扩
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5楼2011-12-10 12:15:53
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世外清风

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
基因组DNA扩过没问题，takara的LA可以，可以尝试下两步法试试
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6楼2011-12-10 16:53:41
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chenglong_li

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
问题一样啊，3kb多的片段，扩了一个月，也没有好的电泳结果。
我分析或许与所扩增的基因有关系，其高级结果比较复杂，变性时间短的话解链不充分，变性时间长的话造成模板损伤，退火温度高的话引物与模板结合不充分，退火温度低的话造成非特异性条带，延伸过程rTaq酶每分钟1kb。
一些见解，供交流！
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为天地立心，为生民立命，为往圣继绝学，为万世开太平。
7楼2012-04-02 10:40:59
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wlwabcd

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
TM值，引物，Mg2+浓度等有可能出问题。你要扩基因组还是cDNA？
如果是基因组的话可以
①先扩大片段，回收后以大片段为模板继续扩增。
②先分段扩增，回收后混合作模板扩增基因。
如果是cDNA，首先建议你用actin检测一下cDNA质量。cDNA没问题建议重新设计引物，可以在UTR区设计；或者可以换一种酶试试。我用takara的Primerstar扩3k的cDNA完全没问题，这个酶的保真性也很好。或者KOD也可以，KOD的扩增能力很强，保真性不如Primerstar。
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8楼2012-04-06 21:48:29
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小蛐蛐第一名

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

谢谢大家的经验，我也遇到同样的问题，好高兴呀！
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9楼2012-12-20 21:08:02
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