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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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angelee

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助!大片段4kb左右基因PCR克隆方法 已有2人参与

求助!大片段4kb左右基因PCR克隆方法。之前,设计引物以cDNA为模板扩增,结果没有任何条带,究竟是为什么呢?求解答~
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wlwabcd

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
TM值,引物,Mg2+浓度等有可能出问题。你要扩基因组还是cDNA?
如果是基因组的话可以
①先扩大片段,回收后以大片段为模板继续扩增。
②先分段扩增,回收后混合作模板扩增基因。
如果是cDNA,首先建议你用actin检测一下cDNA质量。cDNA没问题建议重新设计引物,可以在UTR区设计;或者可以换一种酶试试。我用takara的Primerstar扩3k的cDNA完全没问题,这个酶的保真性也很好。或者KOD也可以,KOD的扩增能力很强,保真性不如Primerstar。
8楼2012-04-06 21:48:29
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shaquila

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

大片段的反转是个问题哦
2楼2011-12-10 07:49:21
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zhaoyonggang

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
lstt09nk(金币+2): 鼓励交流 2011-12-10 10:56:18
先看看引物设计问题,Tm是不是太低了,有没有引物二聚体。

如果引物设计没有问题的话,看看cDNA序列中有没有高GC含量的片段等difficult 序列。有得话,试试two-step PCR,或者加点DMSO或甜菜碱。去网上google一下吧,会有有用的信息的。

4Kb不算太大,应该是没问题的。
3楼2011-12-10 10:03:06
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cxl_yll

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


lstt09nk(金币+1): 9000哦,很厉害哦 2011-12-10 10:56:37
用takara的la taq酶,我9000都出来了,不过概率很小
4楼2011-12-10 10:34:26
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