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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助！大片段4kb左右基因PCR克隆方法
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angelee

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助！大片段4kb左右基因PCR克隆方法 已有2人参与

求助！大片段4kb左右基因PCR克隆方法。之前，设计引物以cDNA为模板扩增，结果没有任何条带，究竟是为什么呢？求解答~
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1楼 2011-12-09 21:45:08
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wlwabcd

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
TM值，引物，Mg2+浓度等有可能出问题。你要扩基因组还是cDNA？
如果是基因组的话可以
①先扩大片段，回收后以大片段为模板继续扩增。
②先分段扩增，回收后混合作模板扩增基因。
如果是cDNA，首先建议你用actin检测一下cDNA质量。cDNA没问题建议重新设计引物，可以在UTR区设计；或者可以换一种酶试试。我用takara的Primerstar扩3k的cDNA完全没问题，这个酶的保真性也很好。或者KOD也可以，KOD的扩增能力很强，保真性不如Primerstar。
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8楼2012-04-06 21:48:29
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shaquila

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

大片段的反转是个问题哦
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2楼2011-12-10 07:49:21
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zhaoyonggang

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
lstt09nk(金币+2): 鼓励交流 2011-12-10 10:56:18
先看看引物设计问题，Tm是不是太低了，有没有引物二聚体。

如果引物设计没有问题的话，看看cDNA序列中有没有高GC含量的片段等difficult 序列。有得话，试试two-step PCR，或者加点DMSO或甜菜碱。去网上google一下吧，会有有用的信息的。

4Kb不算太大，应该是没问题的。
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3楼2011-12-10 10:03:06
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cxl_yll

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
lstt09nk(金币+1): 9000哦，很厉害哦 2011-12-10 10:56:37
用takara的la taq酶，我9000都出来了，不过概率很小
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4楼2011-12-10 10:34:26
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