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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】PCR法克隆基因
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wangxueqin

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】PCR法克隆基因 已有6人参与

请教一下各位大侠：
我现在要克隆一个基因，在水稻里面是长3000bp左右，没有内含子，可以设计引物先扩增出中间一段，然后根据已经序列，设计单引物，一直朝两头扩增，这样的思路可以么？是否可以扩增出来整个完整的基因。
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1楼 2010-05-13 09:52:34
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主
★
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一般可以先扩增保守序列，然后设计基因特异性引物，做RACE（建议），Tail-PCR,genome walking等等。你说的单引物恐怕是行不通的。。。
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几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
2楼2010-05-13 10:04:22
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wangxueqin

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by fungixx at 2010-05-13 10:04:22:
一般可以先扩增保守序列，然后设计基因特异性引物，做RACE（建议），Tail-PCR,genome walking等等。你说的单引物恐怕是行不通的。。。

这个基因已经有人太这个种里面克隆过了，用RACE法行不通，说是GC含量太高了，就只扩增出了中间一小个片段，大概800bp左右的，可能结果不好分析，他们就没有把序列上传到NCBI上面，所以我现在也查不到序列。我们之前也考虑用RACE法，但我老板说直接拿DNA来扩了看看结果，再用单引物扩。

你说的tail pcr, genome walking适合GC含量高的序列么？
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3楼2010-05-13 15:39:52
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
你现在到底是知道序列还是不知道啊，说明白点，3000多是怎么知道的
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4楼2010-05-13 23:33:36
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zcqcau

铁杆木虫 (著名写手)
★
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对啊，楼主的话语有些矛盾啊
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将有能量帮助他人作为自己的人生追求！
5楼2010-05-13 23:48:49
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wangxueqin

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yujiaping1 at 2010-05-13 23:33:36:
你现在到底是知道序列还是不知道啊，说明白点，3000多是怎么知道的

这个基因在水稻里面是3000多bp，单拷贝，没有内含子的。我是设计的简并引物，在竹子里面来扩这个基因，设计回来的引物，退火温度已经升到68度了，还是两条很整齐亮度一致的带，大小在800bp左右，两条带之间差了可能100个bp，郁闷啊，可能是引物 问题了？目前的考虑是割胶，不知道行不行得通。都不知道哪个是杂带，郁闷啊。

是有别人也在竹子里面扩过这个基因，但是他们的序列没有上传到NCBI上面，所以也查不着。
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6楼2010-05-14 13:47:37
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
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scelab(金币+2):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-05-14 21:12:37
同源克隆的话，建议你还是做一下RACE吧，测序后再扩全基因，不然的话扩增片段还可以，想拿到整个阅读框就比较困难了
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7楼2010-05-14 19:28:39
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gastrodia

金虫 (正式写手)
★
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水稻基因组不是已经完成了吗？既然没有内含子你可以直接根据DNA序列设计引物进行扩增啊
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8楼2010-05-14 19:53:06
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过氧化氢

铁虫 (初入文坛)
★
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3000多bp多长了点
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9楼2010-05-14 22:52:21
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