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wangxueqin

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】PCR法克隆基因已有6人参与

请教一下各位大侠:
我现在要克隆一个基因,在水稻里面是长3000bp左右,没有内含子,可以设计引物先扩增出中间一段,然后根据已经序列,设计单引物,一直朝两头扩增,这样的思路可以么?是否可以扩增出来整个完整的基因。
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

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一般可以先扩增保守序列,然后设计基因特异性引物,做RACE(建议),Tail-PCR,genome walking等等。你说的单引物恐怕是行不通的。。。
几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
2楼2010-05-13 10:04:22
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wangxueqin

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by fungixx at 2010-05-13 10:04:22:
一般可以先扩增保守序列,然后设计基因特异性引物,做RACE(建议),Tail-PCR,genome walking等等。你说的单引物恐怕是行不通的。。。

这个基因已经有人太这个种里面克隆过了,用RACE法行不通,说是GC含量太高了,就只扩增出了中间一小个片段,大概800bp左右的,可能结果不好分析,他们就没有把序列上传到NCBI上面,所以我现在也查不到序列。我们之前也考虑用RACE法,但我老板说直接拿DNA来扩了看看结果,再用单引物扩。

你说的tail pcr, genome walking适合GC含量高的序列么?
3楼2010-05-13 15:39:52
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yujiaping1

木虫 (著名写手)

你现在到底是知道序列还是不知道啊,说明白点,3000多是怎么知道的
4楼2010-05-13 23:33:36
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zcqcau

铁杆木虫 (著名写手)


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对啊,楼主的话语有些矛盾啊
将有能量帮助他人作为自己的人生追求!
5楼2010-05-13 23:48:49
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wangxueqin

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by yujiaping1 at 2010-05-13 23:33:36:
你现在到底是知道序列还是不知道啊,说明白点,3000多是怎么知道的

这个基因在水稻里面是3000多bp,单拷贝,没有内含子的。我是设计的简并引物,在竹子里面来扩这个基因,设计回来的引物,退火温度已经升到68度了,还是两条很整齐亮度一致的带,大小在800bp左右,两条带之间差了可能100个bp,郁闷啊,可能是引物 问题了?目前的考虑是割胶,不知道行不行得通。都不知道哪个是杂带,郁闷啊。

是有别人也在竹子里面扩过这个基因,但是他们的序列没有上传到NCBI上面,所以也查不着。
6楼2010-05-14 13:47:37
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yujiaping1

木虫 (著名写手)

★ ★ ★
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scelab(金币+2):欢迎多来交流!:tiger06: 2010-05-14 21:12:37
同源克隆的话,建议你还是做一下RACE吧,测序后再扩全基因,不然的话扩增片段还可以,想拿到整个阅读框就比较困难了
7楼2010-05-14 19:28:39
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gastrodia

金虫 (正式写手)


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水稻基因组不是已经完成了吗?既然没有内含子你可以直接根据DNA序列设计引物进行扩增啊
8楼2010-05-14 19:53:06
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过氧化氢

铁虫 (初入文坛)


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3000多bp多长了点
9楼2010-05-14 22:52:21
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