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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】基因克隆前PCR产物都要纯化吗？
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xiaoru2010

[交流] 【求助/交流】基因克隆前PCR产物都要纯化吗？已有12人参与

如题，PCR产物克隆测序，结果会出现别的基因或比对不出任何东西，会不会是产物纯度不够，需要纯化？请问这个纯化有多重要？？谢啦
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1楼2010-06-29 09:40:55
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琴瑟不鸣

铁虫 (小有名气)
★ ★
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1949stone(金币+1):谢谢交流 2010-06-29 17:19:19
最好是要啊，，，但是不纯化也可以啊
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老虎
2楼2010-06-29 09:47:02
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阿娇

金虫 (正式写手)
★
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1949stone:有些不用纯化 现在好多纯花费都是这些销售的人强加的 2010-06-29 17:20:07
据我们老板说非常重要。要不然测序的峰会有重叠的导致读不出碱基
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3楼2010-06-29 09:58:28
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xiaoru2010

引用回帖:
Originally posted by 阿娇 at 2010-06-29 09:58:28:
据我们老板说非常重要。要不然测序的峰会有重叠的导致读不出碱基

谢谢美女
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4楼2010-06-29 10:05:31
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dianaofyezi

金虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1949stone(金币+1):有些也不需要 2010-06-29 17:20:24
如果直接是PCR产物测序肯定是需要纯化的，否则结果不仅仅是重叠峰的问题了。
如果是克隆的话，一般都是建议纯化的。纯化后可以将PCR产物里面的缓冲体系改变，增加做克隆的成功率等。但是如果有些人比较有经验的看到只有一条特异性的带，直接做克隆的也有。但是我知道的基本都是纯化后做克隆的。
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52187644
5楼2010-06-29 10:38:54
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thh2008

铜虫 (初入文坛)
★
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看天:怎么才1个BB 奖励新人 常来生物科学 2010-06-29 11:01:58
引用回帖:
Originally posted by dianaofyezi at 2010-06-29 10:38:54:
如果直接是PCR产物测序肯定是需要纯化的，否则结果不仅仅是重叠峰的问题了。
如果是克隆的话，一般都是建议纯化的。纯化后可以将PCR产物里面的缓冲体系改变，增加做克隆的成功率等。但是如果有些人比较有经验的看 ...

我们一般也是一条特异带，电泳后凝胶回收做克隆，这样量会减少，再纯化后会不会更少？
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6楼2010-06-29 10:44:46
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dianaofyezi

金虫 (正式写手)
★ ★
看天(金币+1):鼓励回答 2010-06-29 11:01:26
1949stone(金币+1):谢谢交流 2010-06-29 17:20:45
[quote]Originally posted by thh2008 at 2010-06-29 10:44:46:

我们一般也是一条特异带，电泳后凝胶回收做克隆，这样量会减少，再纯化后会不会更少？ [/quot

纯化后会出现回收率问题，但是如果你做了凝胶回收我觉得还是可以的。有的时候你也可以采用无水乙醇沉淀方法来做，但是这样耗费的时间比较长。或者选择回收率比较高的试剂盒。
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52187644
7楼2010-06-29 10:48:33
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zsxnd

铁杆木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by 阿娇 at 2010-06-29 09:58:28:
据我们老板说非常重要。要不然测序的峰会有重叠的导致读不出碱基

对头
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8楼2010-06-29 10:58:23
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375050424

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
如果跑胶的结果是单一条带的话就可以偷懒了，不过最好还是严谨一点
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9楼2010-06-29 12:02:12
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ben1147

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
即使单一条带也建议切胶纯化后再做克隆
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10楼2010-06-29 12:16:00
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