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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助！大片段4kb左右基因PCR克隆方法
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cxl_yll

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
10楼: Originally posted by mimi糖砣 at 2014-07-10 14:08:04
想请教一下，我最近想克隆七八千左右的，用cDNA克隆，请问能不能指点一些细节，比如反转录什么酶比较好，有没有检测cDNA的质量，引物设计需要注意什么，有没有分段克隆的经验？问题比较多，非常感谢分享~...

我用的LA tag预混装的，P了1个月，就P出5次，你可能需要换一种方法，基本做一次PCR需要10个小时吧，3年前做的细节忘记的差不多了，我给你回信了...
分段克隆需要找到合适的酶切位点吧，一般好的酶切位点都没占用了，还有链接的时候有时候需要看一下方向...
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11楼2014-07-11 10:03:43
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

3kd-20kd的DNA片段适用长片段PCR扩增。

长片段PCR不同于一般PCR的特殊要求

1.用Taq-LA DNA聚合酶，该酶是Taq酶或Klentaq 1（无纠错功能）与pfu酶或Deep Vent酶（有纠错功能）的混合物，以Taq酶为主。
2.当需要扩增的片段大于20kd时，需要加入高浓度的甜茶碱（终浓度为1.5-2.0mol/L)，提高PCR的效率，但是甜茶碱加入后，要将扩增反应的温度降低2-3度。楼主的扩增片段还到不了20kd,甜茶碱可以少加点。
3.适当升高镁离子浓度，不要太高了镁离子浓度高于底物dNTP浓度即可。
4.变性时间要短，尤其是一般不超过30 s，尤其是模板长度超过8KD时更是如此，变性时间长会破坏模板。
5.延伸温度可以下降为68摄氏度，同时加长延伸反应时间，长度为3-5kd的模板延伸反应时间为5-10分钟，长度为20-35kd的模板延伸反应时间为20分钟，楼主的PCR的延伸反应时间可能为12-16分钟左右。
6.模板浓度最好在1ng/L以内。
7.应用长片段PCR缓冲溶液。10X长片段PCR缓冲溶液组成为：500 mmol/L Tris-Cl(pH=9.0),160 mmol/L硫酸铵，25 mmol/L MgCl2,1.5mmol/L BSA。
8.设计较长的PCR引物（25-30 bp)
其他同普通PCR。
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12楼2014-07-11 10:46:19
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mimi糖砣

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
11楼: Originally posted by cxl_yll at 2014-07-11 10:03:43
我用的LA tag预混装的，P了1个月，就P出5次，你可能需要换一种方法，基本做一次PCR需要10个小时吧，3年前做的细节忘记的差不多了，我给你回信了...
分段克隆需要找到合适的酶切位点吧，一般好的酶切位点都没占用了 ...

谢谢谢谢 ~~非常感谢  还要慢慢摸索
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13楼2014-07-15 12:38:47
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15905170271

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 凌波丽 at 2014-07-11 10:46:19
3kd-20kd的DNA片段适用长片段PCR扩增。

长片段PCR不同于一般PCR的特殊要求

1.用Taq-LA DNA聚合酶，该酶是Taq酶或Klentaq 1（无纠错功能）与pfu酶或Deep Vent酶（有纠错功能）的混合物，以Taq酶为主。
2.当需 ...

你好，我是新手克隆基因，老师要我克隆4k的基因，但是是从提RNA开始的，请问我每一步都该注意什么呢？我知道较长基因不好pcr，从提RNA开始应该会更难吧~谢谢你啊~
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14楼2015-05-14 11:15:38
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徐官冲123

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by zhaoyonggang at 2011-12-10 10:03:06
先看看引物设计问题，Tm是不是太低了，有没有引物二聚体。

如果引物设计没有问题的话，看看cDNA序列中有没有高GC含量的片段等difficult 序列。有得话，试试two-step PCR，或者加点DMSO或甜菜碱。去网上google一下 ...

你好，我问一下我用的是TAKARA家的primerstar保真酶克隆6.5kb的片段，自认为按照说明书来的，但是没P出来，求克隆过大片段（5kb以上）的高手指教。或者推荐一个好用的酶也可以，十分感谢。引物长度是25，是不是短了？但是说明书上没要求引物长度呀。。。

我用过TAKARA家的 primerstar， 也用过全式金家的 FastPfu fly 保真酶都没P出来。
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15楼2015-07-18 15:38:25
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徐官冲123

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cxl_yll at 2011-12-10 10:34:26
用takara的la taq酶，我9000都出来了，不过概率很小

能给下你的PCR条件和体系吗？参考一下
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16楼2015-07-21 19:27:28
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