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angelee

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助!大片段4kb左右基因PCR克隆方法 已有2人参与

求助!大片段4kb左右基因PCR克隆方法。之前,设计引物以cDNA为模板扩增,结果没有任何条带,究竟是为什么呢?求解答~
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15905170271

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
12楼: Originally posted by 凌波丽 at 2014-07-11 10:46:19
3kd-20kd的DNA片段适用长片段PCR扩增。

长片段PCR不同于一般PCR的特殊要求

1.用Taq-LA DNA聚合酶,该酶是Taq酶或Klentaq 1(无纠错功能)与pfu酶或Deep Vent酶(有纠错功能)的混合物,以Taq酶为主。
2.当需 ...

你好,我是新手克隆基因,老师要我克隆4k的基因,但是是从提RNA开始的,请问我每一步都该注意什么呢?我知道较长基因不好pcr,从提RNA开始应该会更难吧~谢谢你啊~
14楼2015-05-14 11:15:38
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shaquila

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

大片段的反转是个问题哦
2楼2011-12-10 07:49:21
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zhaoyonggang

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
lstt09nk(金币+2): 鼓励交流 2011-12-10 10:56:18
先看看引物设计问题,Tm是不是太低了,有没有引物二聚体。

如果引物设计没有问题的话,看看cDNA序列中有没有高GC含量的片段等difficult 序列。有得话,试试two-step PCR,或者加点DMSO或甜菜碱。去网上google一下吧,会有有用的信息的。

4Kb不算太大,应该是没问题的。
3楼2011-12-10 10:03:06
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cxl_yll

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


lstt09nk(金币+1): 9000哦,很厉害哦 2011-12-10 10:56:37
用takara的la taq酶,我9000都出来了,不过概率很小
4楼2011-12-10 10:34:26
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