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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助！大片段4kb左右基因PCR克隆方法
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angelee

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助！大片段4kb左右基因PCR克隆方法 已有2人参与

求助！大片段4kb左右基因PCR克隆方法。之前，设计引物以cDNA为模板扩增，结果没有任何条带，究竟是为什么呢？求解答~
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1楼 2011-12-09 21:45:08
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徐官冲123

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by zhaoyonggang at 2011-12-10 10:03:06
先看看引物设计问题，Tm是不是太低了，有没有引物二聚体。

如果引物设计没有问题的话，看看cDNA序列中有没有高GC含量的片段等difficult 序列。有得话，试试two-step PCR，或者加点DMSO或甜菜碱。去网上google一下 ...

你好，我问一下我用的是TAKARA家的primerstar保真酶克隆6.5kb的片段，自认为按照说明书来的，但是没P出来，求克隆过大片段（5kb以上）的高手指教。或者推荐一个好用的酶也可以，十分感谢。引物长度是25，是不是短了？但是说明书上没要求引物长度呀。。。

我用过TAKARA家的 primerstar， 也用过全式金家的 FastPfu fly 保真酶都没P出来。
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15楼2015-07-18 15:38:25
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shaquila

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

大片段的反转是个问题哦
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2楼2011-12-10 07:49:21
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zhaoyonggang

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
lstt09nk(金币+2): 鼓励交流 2011-12-10 10:56:18
先看看引物设计问题，Tm是不是太低了，有没有引物二聚体。

如果引物设计没有问题的话，看看cDNA序列中有没有高GC含量的片段等difficult 序列。有得话，试试two-step PCR，或者加点DMSO或甜菜碱。去网上google一下吧，会有有用的信息的。

4Kb不算太大，应该是没问题的。
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3楼2011-12-10 10:03:06
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cxl_yll

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
lstt09nk(金币+1): 9000哦，很厉害哦 2011-12-10 10:56:37
用takara的la taq酶，我9000都出来了，不过概率很小
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4楼2011-12-10 10:34:26
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