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angelee

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助!大片段4kb左右基因PCR克隆方法 已有2人参与

求助!大片段4kb左右基因PCR克隆方法。之前,设计引物以cDNA为模板扩增,结果没有任何条带,究竟是为什么呢?求解答~
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cxl_yll

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
10楼: Originally posted by mimi糖砣 at 2014-07-10 14:08:04
想请教一下,我最近想克隆七八千左右的,用cDNA克隆,请问能不能指点一些细节,比如反转录什么酶比较好,有没有检测cDNA的质量,引物设计需要注意什么,有没有分段克隆的经验?问题比较多,非常感谢分享~...

我用的LA tag预混装的,P了1个月,就P出5次,你可能需要换一种方法,基本做一次PCR需要10个小时吧,3年前做的细节忘记的差不多了,我给你回信了...
分段克隆需要找到合适的酶切位点吧,一般好的酶切位点都没占用了,还有链接的时候有时候需要看一下方向...
11楼2014-07-11 10:03:43
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shaquila

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

大片段的反转是个问题哦
2楼2011-12-10 07:49:21
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zhaoyonggang

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
lstt09nk(金币+2): 鼓励交流 2011-12-10 10:56:18
先看看引物设计问题,Tm是不是太低了,有没有引物二聚体。

如果引物设计没有问题的话,看看cDNA序列中有没有高GC含量的片段等difficult 序列。有得话,试试two-step PCR,或者加点DMSO或甜菜碱。去网上google一下吧,会有有用的信息的。

4Kb不算太大,应该是没问题的。
3楼2011-12-10 10:03:06
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cxl_yll

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


lstt09nk(金币+1): 9000哦,很厉害哦 2011-12-10 10:56:37
用takara的la taq酶,我9000都出来了,不过概率很小
4楼2011-12-10 10:34:26
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