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zhangwuhui铜虫 (小有名气)
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[交流]
【求助/交流】基因克隆实验为非目的片段？ 已有16人参与
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克隆实验问题 1、以cDNA为模板做PCR反应，得到的产物和预期的长度一样。 2、再用pMD-19载体连接目的片段，之后液体LB（含氨苄）200转震荡培养1-2小时，取300微升倒在LB平板培养24小时左右，以阳性菌落长到直径1-2毫米为止；再挑3-5个阳性单克隆放大培养24小时左右。 3、裂解菌体，4°C ，12 000 g ，离心20-30分钟，得到质粒。 4、PCR检测所得质粒（引物为M13-47, RV-M），得到了目的片段大小的产物（稍长些）。 5、送质粒测序（使用通用引物M13-47），但是测序结果却是如下其概况：在载体插入点之间的序列BLAST后，显示为杆菌等细菌的片段，共送了10个样品均是如此（本实验应该是动物的序列），看来不是空载，难道是载体连接上了细菌的一段序列，为什么会插入细菌片段呢，而且长度就这么巧！还是其他什么原因呢，恳请赐教！ [ Last edited by zhangwuhui on 2010-7-29 at 18:31 ] |
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