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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】基因克隆实验为非目的片段？
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zhangwuhui

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 毛毛2802 at 2010-08-02 23:14:28:
请问一下楼主，我看到你的提取质粒的步骤十分简单啊，“裂解菌体，4°C ，12 000 g ，离心20-30分钟，得到质粒”，我想问一下你加的裂解液是什么啊，然后加完就真的离心半小时就得到质粒了吗？纯度如何啊，不会有 ...

十分感谢你的关注！提取质粒的方法是从国外得到的，实践证明是可行的，该方法没有问题，值得信赖。
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11楼2010-08-03 22:06:54
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毛毛2802

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
那请问可以告诉我裂解液的配方吗？十分感谢！十分感谢！
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12楼2010-08-04 16:46:37
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zhangwuhui

铜虫 (小有名气)

问题如何解决？

提高连接效率可能是解决的较好办法。
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13楼2010-10-22 14:50:08
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zhangwuhui

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 毛毛2802 at 2010-08-04 16:46:37:
那请问可以告诉我裂解液的配方吗？十分感谢！十分感谢！

EDTA
Tris-HCl
蛋白酶K
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14楼2010-10-22 14:51:34
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zgw1016

铁杆木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
会不会是连接的时候出的问题，PCR产物未纯化？
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15楼2010-10-22 21:07:03
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asdfghjkl-00

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by stephenreal at 2010-07-27 11:11:14:
千万别图省事，在转化时按照分子克隆的要求，加上载体对照、阴性对照（以LB或者SOB代替克隆基因）或无关对照（其它基因片段），这样应该能查出原因。而一般人做的时候，就只转1个阳性的。与其碰运气，还不如严格一 ...

我想请问一下，载体对照是怎么做的？
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16楼2010-10-25 17:23:36
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zhangwuhui

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by zgw1016 at 2010-10-22 21:07:03:
会不会是连接的时候出的问题，PCR产物未纯化？

也曾怀疑过连接出问题了。但还是没明白如果连接出问题，用通用引物做PCR时应该不能得到预期长度的产物呀！
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17楼2010-10-26 10:49:21
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stephenreal

至尊木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by asdfghjkl-00 at 2010-10-25 17:23:36:

我想请问一下，载体对照是怎么做的？

就空质粒，它的转化效率很高的，如果这个效率很低，多半是感受态不行
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18楼2010-10-26 15:21:36
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Flairy825

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
做的过程中一定做对照还有防止污染
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19楼2010-10-26 15:29:17
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zgw1016

铁杆木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by zhangwuhui at 2010-10-26 10:49:21:

也曾怀疑过连接出问题了。但还是没明白如果连接出问题，用通用引物做PCR时应该不能得到预期长度的产物呀！

那可以试试用自己设计的引物，就是目的片段两端的引物进行PCR，看能不能得到目的片段？

[ Last edited by zgw1016 on 2010-10-27 at 17:34 ]
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20楼2010-10-27 17:33:14
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