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哪位好心人给我讲讲DGGE后切胶回收、连接、转化、克隆到测序的过程？？
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最好是通俗点的语言，而且又能讲出步骤的细节和原理。 跪谢. 还有切胶之后，怎么再次PCR，我看文献里有再次PCR，然后去测序的。怎么知道切下来的条带是什么，然后涉及引物？ |
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感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+4, 鼓励应助 2012-10-28 17:51:16
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| 用灭菌的手术刀片将不同迁移率的DGGE条带尽可能多的进行切割，放入含40 μl无菌ddH2O的EP管中，4℃过夜，以1 μl 该溶液为模板，以不加GC夹的相应引物进行PCR扩增，扩增体系和程序参照之前加GC夹条件差不多。重新扩增的PCR产物与pMD19-T Simple vector (Takara Bio- technology (Dalian) Co. Ltd., Dalian, China) 进行连接，采用热激法转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，从涂布有Amp (100μg•ml-1)、X-gal (20μg•ml-1)和IPTG (40μg•ml-1)的LB平板挑选含有重组子的白色菌落，以pMD19-T Simple 载体上的RV-M(GAGCGGATAACAATTTCACA- CAGG 和 M13-47 (CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC) 为引物，验证阳性克隆。25 μL PCR反应体系为10 × Taq DNA polymerase buffer 2.5 μL，25 mM MgCl2 1.5 μL，引物RV-M和M13-47 (10μM）各0.5 μL，2.5 mM dNTP 2 μL，5 U/μL Taq酶 0.15 μL，大肠杆菌单菌落为模板，ddH2O补足至25 μL。PCR反应条件为：94℃ 预变性 5 min；94℃变性0.5min，54℃退火0.5 min，72℃延伸1.5min，循环30次；72℃延伸5min，1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。挑取阳性克隆子送上海英骏生物技术有限公司进行序列测定。测定的16S rDNA V3区序列在GenBank数据库中进行比对,并申请序列登陆号。 |
5楼2012-10-28 16:29:23
6楼2012-10-28 23:10:06
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