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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 哪位好心人给我讲讲DGGE后切胶回收、连接、转化、克隆到测序的过程？？
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qq677556

新虫 (初入文坛)

[求助] 哪位好心人给我讲讲DGGE后切胶回收、连接、转化、克隆到测序的过程？？

最好是通俗点的语言，而且又能讲出步骤的细节和原理。
跪谢.
还有切胶之后，怎么再次PCR，我看文献里有再次PCR，然后去测序的。怎么知道切下来的条带是什么，然后涉及引物？
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1楼 2012-10-28 02:05:07
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ll9999

专家顾问 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
看看这里：
http://wenku.baidu.com/view/747a747101f69e314332947b.html
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2楼2012-10-28 08:09:56
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asdkingstar

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
这个我刚做过，切胶后，经LB培养后，进行PCR，阳性克隆鉴定，测序。
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爱是浅浅的喜欢，喜欢是浅浅的爱。
3楼2012-10-28 08:46:58
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qq677556

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by asdkingstar at 2012-10-28 08:46:58
这个我刚做过，切胶后，经LB培养后，进行PCR，阳性克隆鉴定，测序。

能不能具体点。嘿嘿
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4楼2012-10-28 16:21:54
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zhaojin2399

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+4, 鼓励应助 2012-10-28 17:51:16
用灭菌的手术刀片将不同迁移率的DGGE条带尽可能多的进行切割，放入含40 μl无菌ddH2O的EP管中，4℃过夜，以1 μl 该溶液为模板，以不加GC夹的相应引物进行PCR扩增，扩增体系和程序参照之前加GC夹条件差不多。重新扩增的PCR产物与pMD19-T Simple vector (Takara Bio- technology (Dalian) Co. Ltd., Dalian, China) 进行连接，采用热激法转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，从涂布有Amp (100μg•ml-1)、X-gal (20μg•ml-1)和IPTG (40μg•ml-1)的LB平板挑选含有重组子的白色菌落，以pMD19-T Simple 载体上的RV-M(GAGCGGATAACAATTTCACA- CAGG 和 M13-47 (CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC) 为引物，验证阳性克隆。25 μL PCR反应体系为10 × Taq DNA polymerase buffer 2.5 μL，25 mM MgCl2 1.5 μL，引物RV-M和M13-47 (10μM）各0.5 μL，2.5 mM dNTP 2 μL，5 U/μL Taq酶 0.15 μL，大肠杆菌单菌落为模板，ddH2O补足至25 μL。PCR反应条件为：94℃ 预变性 5 min；94℃变性0.5min，54℃退火0.5 min，72℃延伸1.5min，循环30次；72℃延伸5min，1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。挑取阳性克隆子送上海英骏生物技术有限公司进行序列测定。测定的16S rDNA V3区序列在GenBank数据库中进行比对,并申请序列登陆号。
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5楼2012-10-28 16:29:23
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qq677556

新虫 (初入文坛)
切胶之后 进行PCR 此次PCR引物和第一次相同吗  扩增出来的片段长度相同吗
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6楼2012-10-28 23:10:06
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hkksmile

新虫 (初入文坛)
用不带GC 夹的引物扩 片段会短一点
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7楼2012-11-22 14:52:30
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匿名

用户注销 (初入文坛)
★
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-29 19:07:33
本帖仅楼主可见
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8楼2013-05-28 17:18:34
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