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[交流]
双酶切后载体片段变小
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本人实验中遇到点问题，现将详细过程书写如下，并附带详细的参考信息。 目的基因长度：900bp 目的基因的前端有NdeI酶切位点，后端有BamHI酶切位点。目的基因是由公司合成好以后构建到pGEM-T载体上，转化到DH5α中。 pET3a（大小4640bp） pET20b（大小3716bp） 以及pGEM-T（大小3000bp）都是转化到DH5α中，提取质粒以后做双酶切的时候都载体的大小正确（如图1），可以排除同源重组的可能性。  图1 （图1）提取质粒后做双酶切，从图中可以看到pET3a和pT-taget质粒都已经完全切开，且载体与目的基因的大小都正确。注：pT-taget双酶切以后载体有两条带，这是因为目的基因和T载体上都带有NdeI酶切位点，目的基因的末端A与T载体的T相连时存在正反向相连两种情况，目的基因大小为900bp左右，所以在没有完全切开质粒的时候载体会与两种情况，大小相差900bp左右。  图2 （图2）目的基因双酶切后分别与pET3a和pET20b相连接，转化DH5α细胞，挑取单克隆提质粒双酶切后的电泳结果。图中用DH5α中提取的pET3a和pET20b质粒做的双酶切作为载体的对照；连接后双酶切目的基因的条带大小正确，但载体的大小发生改变，都比原先载体片段小。 我的问题就是，为什么连接了以后原先的载体会变小（已经重复了多次实验，更换了感受态细胞，重新提质粒，重新酶切的载体等等）。  图3 （图3）pET3a-target与pET20b-target分别用NdeI和BamHI做单酶切；3a加目的基因条带应该在5000左右，处于Marker10000中从上数第三条带4000以上，然而切出来的条带位于4000一下；同样，20b载体单酶切后加上目的条带也应在4000以上。 总的来说，目的基因连入载体以后，载体序列酶切后发生的构象的改变，导致条带位置发生改变，请问这具体的原因是什么呢？  pGEM-T  pET-3a  pET-20b [ Last edited by shoppinggirl on 2012-8-18 at 19:13 ] |
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