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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 载体酶切位点与目的片段重复
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MOQIA1989

新虫 (初入文坛)

[求助] 载体酶切位点与目的片段重复

第一次做分子实验，选择了PMD-19T载体，连接目的片段后，再亚克隆到PET-28a上，现在遇到了个问题，就是当时在设计引物加酶切位点时，只考虑到了PET-28a和目的片段，设计出的酶切位点在PMD-19T上都有，怎么吧啊，可以用吗，加的位点是HindⅢ和EcoRⅠ。。。。大家帮帮忙吧。。。
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1楼 2013-06-25 09:36:32
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rv1nm2y

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhangxingc: 金币+3, 鼓励新虫应助，欢迎常到微生物版 2013-06-25 11:41:38
和我用的酶切位点是一样的，我用了pEt28a+
PMD-19T载体应该只是一个保留这个目的片段的把？用PCR扩增，设计引物，这时候引物就该注意点了，引物就包括ECORI 和HindIII酶切位点最好再弄点你们的目标基因的片段，要不然估计会把PMD-19T的基因给扩增出来，这样子就只扩增含有酶切位点的目标基因了，然后琼脂糖电泳一下看看有没有扩增出来目标基因。
随后目标基因和pEt28a+同时进行双酶切，DNA连接酶16℃连接过夜，然后再做一个琼脂糖电泳，一个是连接之后的，还有一个是没有连接的目标基因和pet28a都进行酶切之后的混合液，跑完电泳看看有没有顺利连接就好了。
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2楼2013-06-25 11:34:00
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MOQIA1989

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by rv1nm2y at 2013-06-25 11:34:00
和我用的酶切位点是一样的，我用了pEt28a+
PMD-19T载体应该只是一个保留这个目的片段的把？用PCR扩增，设计引物，这时候引物就该注意点了，引物就包括ECORI 和HindIII酶切位点最好再弄点你们的目标基因的片段，要不 ...

在目的片段与PMD-19T连接后，实验预计是用上面两个酶将目的片段切下来，然后电泳，切胶回收目的片段，然后连接PET-28a，但是比如载体ECORI到目的片段ECORI距离是A，目的片段长是B，目的片段hindIII到载体hindIII的距离是C，双酶切后得到的片段长度可能是A+B,A+B+C,B+C,A,B,C。这可怎么办，需要重新设计一条只在pet-28a上有的酶切位点的引物吗？
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3楼2013-06-25 12:36:06
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kehuang611

新虫 (小有名气)
完全可以啊，不用重新设计，本来就不必考虑PMD-19T，应其只是用于克隆测序一般，你用高保真酶扩增你的片段后加A，然后酶连测序，验证你的片段扩增的正确性，然后用你片段中没有酶切位点的酶HindⅢ和EcoRⅠ酶切，这样然后用同酶酶切pEt28a+，酶连就对了，这样过程中完全不必考虑PMD-19T的。
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向大家学习
4楼2013-06-25 12:56:09
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kehuang611

新虫 (小有名气)
★ ★ ★
zhangxingc: 金币+3, 鼓励新虫积极应助 2013-06-25 13:29:04
在目的片段与PMD-19T连接后，实验预计是用上面两个酶将目的片段切下来，然后电泳，切胶回收目的片段，然后连接PET-28a，但是比如载体ECORI到目的片段ECORI距离是A，目的片段长是B，目的片段hindIII到载体hindIII的距离是C，双酶切后得到的片段长度可能是A+B,A+B+C,B+C,A,B,C。这可怎么办，需要重新设计一条只在pet-28a上有的酶切位点的引物吗？

还有这种说法就有问题，楼主应该明白酶切的话只要在酶量做够时，只要有酶切位点就会切开，所以酶切后剩下的只会是带两段酶切末端的你的片段。
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向大家学习
5楼2013-06-25 12:59:20
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MOQIA1989

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by kehuang611 at 2013-06-25 12:59:20
在目的片段与PMD-19T连接后，实验预计是用上面两个酶将目的片段切下来，然后电泳，切胶回收目的片段，然后连接PET-28a，但是比如载体ECORI到目的片段ECORI距离是A，目的片段长是B，目的片段hindIII到载体hindIII的距 ...

然后我进行电泳，回收后就可以得到所需的目的片段了吧？在回收的片段中应该不含有被切断的载体片段吧？

原谅我的科普期。。。。。老板已经快被问吐血了，现在正在养伤。。。。只能求助大家了
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6楼2013-06-25 13:08:27
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rv1nm2y

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

这样的，你的目标基因和PMD-19T连接之后不需要酶切，只需要设置前后引物然后扩增出来目标基因，不需要酶切的，把引物设计出来之后，就只扩增引物之间的目标基因。
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7楼2013-06-25 13:13:53
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rv1nm2y

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
zhangxingc: 金币+5, 鼓励新虫热心回帖应助 2013-06-25 13:29:36
因为PMD-19T只作为一个保存目标基因的一个载体，所以直接扩增即可，不用酶切。它和pet28a+再都双酶切之后连接就好了。
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8楼2013-06-25 13:18:19
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MOQIA1989

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by rv1nm2y at 2013-06-25 13:18:19
因为PMD-19T只作为一个保存目标基因的一个载体，所以直接扩增即可，不用酶切。它和pet28a+再都双酶切之后连接就好了。

是不是说第一次扩增出目的基因与19T连接，目的是测序？测序正确了，再PCR扩增出19T上的目的序列，以保证它的准确性？这样的话我可不可以将目的片段直接双酶切连接到双酶切后的28a上然后去测序？
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9楼2013-06-25 13:23:27
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MOQIA1989

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by rv1nm2y at 2013-06-25 13:13:53
这样的，你的目标基因和PMD-19T连接之后不需要酶切，只需要设置前后引物然后扩增出来目标基因，不需要酶切的，把引物设计出来之后，就只扩增引物之间的目标基因。

这样在测序后再进行一次扩增会不会再次出现不准确的情况呢？实验室里做PCR用的都是taq酶，没有高保真酶，可以吗
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10楼2013-06-25 13:33:37
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