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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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stardu

新虫 (初入文坛)

[求助] 有没有用过XmnI这个酶的?酶切后连接需要注意什么问题么?

我用XmnI做酶切后与质粒pKD46载体连接,但是连了将近4个月了,总是连不上。有没有人做过这类的实验?这个酶切出的是平末端。还有连接时有没有需要注意的问题?这个质粒是温敏型质粒,培养时都是在30摄氏度养的。
  有做过类似实验的高手们,请赐教!小女子在这里拜谢了!我真的快要疯了!
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

引用回帖:
7楼: Originally posted by stardu at 2012-12-29 16:20:53
哦,我直接用LB复苏的,200rpm,1-2h。这个质粒拷贝数是挺低的,我用3mL菌液提的质粒,酶切2管胶回收到一起。另外我是37℃过夜切,这样有影响吗?连接酶加到1.5μL多不多呀?...

质粒拷贝数低可以多摇些菌提质粒。如果实在是少的话载体可以不用胶回收。用少量酶切产物跑电泳确定酶切完全可以直接过column纯化回收酶切产物。连接酶一般是1ul/20ul连接体系就足够的。
8楼2012-12-29 16:38:18
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普通回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
stardu: 金币+3, 有帮助 2012-12-29 16:11:21
目的片段的酶切位点是在末端吗?这个酶没人试过要加多少保护碱基,切割效率不好说啊。如果是PCR产物直接和载体连,需要磷酸化。对载体的酶切时间不要过长,电泳证明切开就可以了,不推荐切过夜。此外载体去磷酸化处理,连接时加大目的片段:载体的比例,16度连过夜应该没问题的。
2楼2012-12-29 11:03:52
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hyacinth326

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你是换抗生素的抗性吧?这个载体我还真这么做过,首先,平末端连接的比例,目的片段:载体=10:1吧,连接酶多加点,然后16度过夜吧,如果你是pcr产物连的话,切记载体不能去磷酸化,因为pcr片段没有磷酸集团,如果你是先连到克隆载体上再做的话,载体可以去磷酸化,还有涂抗性平板的时候,改造过的已经没有amp抗性了,别搞错了
3楼2012-12-29 15:26:50
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stardu

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by hyacinth326 at 2012-12-29 15:26:50
你是换抗生素的抗性吧?这个载体我还真这么做过,首先,平末端连接的比例,目的片段:载体=10:1吧,连接酶多加点,然后16度过夜吧,如果你是pcr产物连的话,切记载体不能去磷酸化,因为pcr片段没有磷酸集团,如果你 ...

对的,是换抗生素的抗性。我的比例是3:1,看来需要调整一下比例。我是先连到T载上再做的,载体没有去磷酸化。我用没有去磷酸化的pKD46质粒自连都没有长。
真的是太感谢你了!我调整连接比例再做一下。另外想问一下,连接后培养的温度与转速影响大么?用37℃还是30℃呢?谢谢你!
4楼2012-12-29 15:42:06
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stardu

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-29 11:03:52
目的片段的酶切位点是在末端吗?这个酶没人试过要加多少保护碱基,切割效率不好说啊。如果是PCR产物直接和载体连,需要磷酸化。对载体的酶切时间不要过长,电泳证明切开就可以了,不推荐切过夜。此外载体去磷酸化处 ...

目的片段的酶切位点是在抗性基因中间,不是在末端。不过我都是酶切过夜,然后回收的。因为是单酶切,载体我用pcr产物回收试剂盒回收的。不知道为什么,做了好几次,这个载体跑胶时有条带,胶回收后再跑胶就完全看不到条带了!
谢谢你哈!
5楼2012-12-29 15:46:18
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hyacinth326

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
stardu: 金币+7, ★★★很有帮助 2012-12-29 16:13:37
估计你酶切后的载体浓度太低了,你可以提质粒的时候浓缩一下,这个载体拷贝数很低很低,好像是1~5copy/cell,慢摇的时候我都是30度,100rpm,1h,用SOC复苏的
6楼2012-12-29 15:59:37
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stardu

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by hyacinth326 at 2012-12-29 15:59:37
估计你酶切后的载体浓度太低了,你可以提质粒的时候浓缩一下,这个载体拷贝数很低很低,好像是1~5copy/cell,慢摇的时候我都是30度,100rpm,1h,用SOC复苏的

哦,我直接用LB复苏的,200rpm,1-2h。这个质粒拷贝数是挺低的,我用3mL菌液提的质粒,酶切2管胶回收到一起。另外我是37℃过夜切,这样有影响吗?连接酶加到1.5μL多不多呀?
7楼2012-12-29 16:20:53
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stardu

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by hyacinth326 at 2012-12-29 15:26:50
你是换抗生素的抗性吧?这个载体我还真这么做过,首先,平末端连接的比例,目的片段:载体=10:1吧,连接酶多加点,然后16度过夜吧,如果你是pcr产物连的话,切记载体不能去磷酸化,因为pcr片段没有磷酸集团,如果你 ...

你好!请问转化时是用热激转化不?还是用电转?连接前需不需要把在加T4 buffer和ligase前先热水浴一下再进行连接呢?当时你做的就是常规的连接步骤吗?
谢谢回复!还会有金币奉上。
9楼2013-01-03 10:20:29
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stardu

新虫 (初入文坛)

没有人做过这个质粒的抗性改造了么?有做过的大侠拯救我吧!
10楼2013-01-04 08:49:42
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