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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 有没有用过XmnI这个酶的?酶切后连接需要注意什么问题么？
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stardu

新虫 (初入文坛)

[求助] 有没有用过XmnI这个酶的?酶切后连接需要注意什么问题么？

我用XmnI做酶切后与质粒pKD46载体连接，但是连了将近4个月了，总是连不上。有没有人做过这类的实验？这个酶切出的是平末端。还有连接时有没有需要注意的问题？这个质粒是温敏型质粒，培养时都是在30摄氏度养的。
  有做过类似实验的高手们，请赐教！小女子在这里拜谢了！我真的快要疯了！
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1楼 2012-12-29 10:52:21
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
7楼: Originally posted by stardu at 2012-12-29 16:20:53
哦，我直接用LB复苏的，200rpm，1-2h。这个质粒拷贝数是挺低的，我用3mL菌液提的质粒，酶切2管胶回收到一起。另外我是37℃过夜切，这样有影响吗？连接酶加到1.5μL多不多呀？...

质粒拷贝数低可以多摇些菌提质粒。如果实在是少的话载体可以不用胶回收。用少量酶切产物跑电泳确定酶切完全可以直接过column纯化回收酶切产物。连接酶一般是1ul/20ul连接体系就足够的。
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8楼2012-12-29 16:38:18
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
stardu: 金币+3, ★有帮助 2012-12-29 16:11:21
目的片段的酶切位点是在末端吗？这个酶没人试过要加多少保护碱基，切割效率不好说啊。如果是PCR产物直接和载体连，需要磷酸化。对载体的酶切时间不要过长，电泳证明切开就可以了，不推荐切过夜。此外载体去磷酸化处理，连接时加大目的片段：载体的比例，16度连过夜应该没问题的。
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2楼2012-12-29 11:03:52
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hyacinth326

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你是换抗生素的抗性吧？这个载体我还真这么做过，首先，平末端连接的比例，目的片段：载体=10:1吧，连接酶多加点，然后16度过夜吧，如果你是pcr产物连的话，切记载体不能去磷酸化，因为pcr片段没有磷酸集团，如果你是先连到克隆载体上再做的话，载体可以去磷酸化，还有涂抗性平板的时候，改造过的已经没有amp抗性了，别搞错了
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3楼2012-12-29 15:26:50
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stardu

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by hyacinth326 at 2012-12-29 15:26:50
你是换抗生素的抗性吧？这个载体我还真这么做过，首先，平末端连接的比例，目的片段：载体=10:1吧，连接酶多加点，然后16度过夜吧，如果你是pcr产物连的话，切记载体不能去磷酸化，因为pcr片段没有磷酸集团，如果你 ...

对的，是换抗生素的抗性。我的比例是3:1，看来需要调整一下比例。我是先连到T载上再做的，载体没有去磷酸化。我用没有去磷酸化的pKD46质粒自连都没有长。
真的是太感谢你了！我调整连接比例再做一下。另外想问一下，连接后培养的温度与转速影响大么？用37℃还是30℃呢？谢谢你！
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4楼2012-12-29 15:42:06
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stardu

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-29 11:03:52
目的片段的酶切位点是在末端吗？这个酶没人试过要加多少保护碱基，切割效率不好说啊。如果是PCR产物直接和载体连，需要磷酸化。对载体的酶切时间不要过长，电泳证明切开就可以了，不推荐切过夜。此外载体去磷酸化处 ...

目的片段的酶切位点是在抗性基因中间，不是在末端。不过我都是酶切过夜，然后回收的。因为是单酶切，载体我用pcr产物回收试剂盒回收的。不知道为什么，做了好几次，这个载体跑胶时有条带，胶回收后再跑胶就完全看不到条带了！
谢谢你哈！
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5楼2012-12-29 15:46:18
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hyacinth326

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
stardu: 金币+7, ★★★很有帮助 2012-12-29 16:13:37
估计你酶切后的载体浓度太低了，你可以提质粒的时候浓缩一下，这个载体拷贝数很低很低，好像是1~5copy/cell，慢摇的时候我都是30度，100rpm，1h，用SOC复苏的
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6楼2012-12-29 15:59:37
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stardu

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by hyacinth326 at 2012-12-29 15:59:37
估计你酶切后的载体浓度太低了，你可以提质粒的时候浓缩一下，这个载体拷贝数很低很低，好像是1~5copy/cell，慢摇的时候我都是30度，100rpm，1h，用SOC复苏的

哦，我直接用LB复苏的，200rpm，1-2h。这个质粒拷贝数是挺低的，我用3mL菌液提的质粒，酶切2管胶回收到一起。另外我是37℃过夜切，这样有影响吗？连接酶加到1.5μL多不多呀？
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7楼2012-12-29 16:20:53
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stardu

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by hyacinth326 at 2012-12-29 15:26:50
你是换抗生素的抗性吧？这个载体我还真这么做过，首先，平末端连接的比例，目的片段：载体=10:1吧，连接酶多加点，然后16度过夜吧，如果你是pcr产物连的话，切记载体不能去磷酸化，因为pcr片段没有磷酸集团，如果你 ...

你好！请问转化时是用热激转化不？还是用电转？连接前需不需要把在加T4 buffer和ligase前先热水浴一下再进行连接呢？当时你做的就是常规的连接步骤吗？
谢谢回复！还会有金币奉上。
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9楼2013-01-03 10:20:29
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stardu

新虫 (初入文坛)
没有人做过这个质粒的抗性改造了么？有做过的大侠拯救我吧！
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10楼2013-01-04 08:49:42
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