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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 单酶切连接转化，感受态的问题？！
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zhaoyu2881

木虫 (正式写手)

[求助] 单酶切连接转化，感受态的问题？！

最近新做了一批DH5α感受态细胞，之后转pBS在LB (amp+)平板上验证了可用。于是做质粒酶切连接，试验如下：
T1: pBS用EcoRV酶切后，插入目的基因；（insert / vecotor=3:1 or 5:1），转化；
CK1 : pBS用EcoRV酶切后，T4 DNA ligase （Fermentas） 自连，转化；（为验证ligation reaction）
CK2 ：直接转化pBS （为再次验证感受态细胞）
后在LB （amp+）上做蓝白斑筛选，可是每个平板上什么都不长了！？这可能是什么原因呢，现在能确定ligase应该没有问题，是新的。

感受态细胞也是验证过的，只是在验证后在4度下放置了一晚，第二天保存在-80度冰箱，请问会是因为这个原因影响了感受态的功能吗？想了很多原因，觉得操作应该没有问题，这可能是什么导致的呢？

急盼各位有经验的前来指教！！谢谢！
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Thatislife,onlylifehurts.
1楼 2012-10-21 03:39:52
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guoxingliu

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhaoyu2881: 金币+2, 谢谢你的回答。我是新做好的质粒验证能用后，在4度放了一晚，然后就一直在-80下保存了，恩，我现在也担心是不是感受态的问题？ 2012-10-21 10:38:55
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-10-22 13:34:45
看了您的实验方案，没什么问题，如果酶切操作、DNA片段的回收都没什么问题，建议重新转化（取来自超低温冷冻的感受态，随取随用），我的经验，放在4℃是绝对不行的，感受态在超低温冰箱冷冻后，都是比较脆弱的，放在4℃条件下保存，肯定影响其效率（我们做的感受态都是放在-150℃保存）。
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2楼2012-10-21 08:58:54
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710002191

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhaoyu2881: 金币+2, 恩，谢谢你的回答。回顾了下几次的试验操作，都觉得没有问题，现在考虑换感受态试试~~ 2012-10-21 10:42:49
自己没做过，看师姐做过，所有操作感受态的过程都是在冰盒里做的，包括短暂的加样过程，还有我自己想会不会是平板的问题，培养时间什么的应该也影响吧
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may
3楼2012-10-21 09:13:55
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tulip1213

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
zhaoyu2881: 金币+1, 呵呵，验证过的都不可靠，不敢不验证啊，恩，考虑重新换感受态了~~ 2012-10-21 10:43:52
做完感受态不需要验证，直接往下做啊。要放负八十度，4度，失活了
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4楼2012-10-21 10:32:17
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
zhaoyu2881: 金币+1, 恩，这下有教训了，打算重新换感受态了~~ 2012-10-21 22:51:22
如果直接转质粒都不长，说明感受态有问题，从新做下感受态。做好后直接用液氮冻了放在-80°C。感受态是不是好用做实验的时候就知道了，可以不必单独验证。
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5楼2012-10-21 13:34:58
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xj0311

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
zhaoyu2881: 金币+1, 恩，谢谢！ 2012-10-21 22:52:04
验证完，感受态应该是没问题的，建议重新连接，再转化验证
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6楼2012-10-21 16:11:23
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boytiger

禁虫 (初入文坛)
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zhaoyu2881
7楼2012-10-21 16:42:53
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小小技术官

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
感受态 不能放4度啊 冻存融化后立即使用才行！
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生活是一面镜子，要笑着面对！
8楼2012-10-21 18:28:19
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zhaoyu2881

木虫 (正式写手)
送鲜花一朵
引用回帖:
7楼: Originally posted by boytiger at 2012-10-21 16:42:53
自己做的感受态细胞的话，最好在24h以内使用。现在也可以直接买现成的感受态细胞，效果很不错的。

恩，好，谢谢！
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Thatislife,onlylifehurts.
9楼2012-10-21 22:53:37
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wt3532

木虫 (著名写手)

涛声依旧

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhaoyu2881: 金币+3, 恩，非常感谢！看了大家的建议，回想了下实验操作，感觉还是有些小的细节没有注意到~~打算重新再做了，呼呼~~ 2012-10-23 04:42:35
自己做的感受态，做好后直接分装放-80冰箱保存。用的时候取一管做，如果要验证感受态问题，取两管，一管做转化的，一个做对照。基本上以我的经验说，自己制作感受态只是效率问题，有的人做的感受态板子上可能找的密密麻麻的好多，有的只是张100个或者很少的几个，但基本上都说阳性的。
还有感受态不管是自作还是转化，除了热激过程，都说需要冰上操作的。
以前见有的人说，这个冰上操作甚至比无菌更重要（离心、悬浮等操作）。如果没有冷冻离心机，我们之前是将小转子放-20冰箱里冻冷，然后缩短离心时间和离心转速，也能制成很好的感受态
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10楼2012-10-22 18:21:23
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