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zhaoyu2881

木虫 (正式写手)

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[求助] 单酶切连接转化，感受态的问题？！

最近新做了一批DH5α感受态细胞，之后转pBS在LB (amp+)平板上验证了可用。于是做质粒酶切连接，试验如下：
T1: pBS用EcoRV酶切后，插入目的基因；（insert / vecotor=3:1 or 5:1），转化；
CK1 : pBS用EcoRV酶切后，T4 DNA ligase （Fermentas）自连，转化；（为验证ligation reaction）
CK2 ：直接转化pBS （为再次验证感受态细胞）
后在LB （amp+）上做蓝白斑筛选，可是每个平板上什么都不长了！？这可能是什么原因呢，现在能确定ligase应该没有问题，是新的。

感受态细胞也是验证过的，只是在验证后在4度下放置了一晚，第二天保存在-80度冰箱，请问会是因为这个原因影响了感受态的功能吗？想了很多原因，觉得操作应该没有问题，这可能是什么导致的呢？

急盼各位有经验的前来指教！！谢谢！

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Thatislife,onlylifehurts.

1楼 2012-10-21 03:39:52

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tulip1213

银虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
zhaoyu2881: 金币+1, 呵呵，验证过的都不可靠，不敢不验证啊，恩，考虑重新换感受态了~~ 2012-10-21 10:43:52

做完感受态不需要验证，直接往下做啊。要放负八十度，4度，失活了

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4楼2012-10-21 10:32:17

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guoxingliu

木虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhaoyu2881: 金币+2, 谢谢你的回答。我是新做好的质粒验证能用后，在4度放了一晚，然后就一直在-80下保存了，恩，我现在也担心是不是感受态的问题？ 2012-10-21 10:38:55
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-10-22 13:34:45

看了您的实验方案，没什么问题，如果酶切操作、DNA片段的回收都没什么问题，建议重新转化（取来自超低温冷冻的感受态，随取随用），我的经验，放在4℃是绝对不行的，感受态在超低温冰箱冷冻后，都是比较脆弱的，放在4℃条件下保存，肯定影响其效率（我们做的感受态都是放在-150℃保存）。

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2楼2012-10-21 08:58:54

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