| 查看: 4885 | 回复: 8 | ||||
| 本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看 | ||||
[求助]
单酶切的大片段连接转化及多个片段的连接转化问题
|
||||
最近做的几个克隆都非常不顺，一个多月了，天天连接转化涂板，天天收的空白板 一个涉及到多片段的连接：700bp+800bp+1.6kb+3.6kb 另一个是大片段单酶切连接（Pac I)：6.7kb+12kb 一直是怀疑连接的效率问题，单转质粒作为阳性对照确定感受态是好的。 具体：（1）多片段连接：确定多片段连接中的几个片段都是酶切彻底的，跑胶，切胶做回收，用的QIAGEN的胶回收试剂盒，但回收率一般，小片段（<1kb)回收后浓度仅达20ng/ul。回收后片段做连接，用的是NEB的T4 DNA ligase，他家的快速连接试剂盒也有试过，均按说明操作（普通连接酶：10ul体系，1ul buffer，0.5ul的酶，其余的均是DNA，室温过夜后转16度；快速连接试剂盒：同上一样的体系，室温5分钟），均未有单菌落生长。 （2）大片段连接：6.7kb的insert质粒和12kb载体质粒均用PacI进行酶切，酶切后跑胶回收，载体片段回收效率很低，不到10ng/ul，insert片段也仅十几ng/ul，同样的用NEB的T4 DNA ligase做连接，10ul体系，1ul buffer，0.5ul的酶，其余的均是DNA，室温过夜后转16度，未见有单克隆生长。 这段时间全耗在连接转化上面了，严重打击了我科研的信心  想求助一下大家在多片段的连接或大片段的连接转化中都需要注意哪方面的问题呢？有大牛帮忙分析分析失败的原因吗？ |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 【分子生物】EPI帖 |
» 猜你喜欢
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有239人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
-
氢氧化钾活化操作
已经有18人回复
-
散金
已经有68人回复
-
生物质超级电容器
已经有0人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 单酶切连接转化，感受态的问题？！
已经有11人回复
- 载体和酶切片段连接的问题
已经有5人回复
- 求助：Xho 1 单酶切 载体连接
已经有19人回复
- 双酶切，连接，转化问题
已经有30人回复
- 双酶切粘性末端连接不上
已经有21人回复
- 酶切后未纯化连接出现的问题
已经有18人回复
- 大片段连接问题
已经有20人回复
- 本人做了双酶切连接转化，真的真的有想死的心了
已经有6人回复
- 做酶切连接后转化再提质粒，质粒明显变小，Why???
已经有24人回复
- 请教一下连接与转化问题！
已经有11人回复
- PCR ， 双酶切，连接问题
已经有17人回复
- 单酶切连接......急
已经有15人回复
- 双酶切连接表达载体，两个月都没做出来，问题到底出在哪里呢~？求指点
已经有52人回复
- 为什么我做的酶切连接总是不长斑呢？
已经有24人回复
- 【求助/交流】关于酶切连接转化的问题
已经有10人回复
- 【求助/交流】连接转化长菌有质粒，但是没有目的片段，怎么回事？？
已经有20人回复
- 【求助/交流】酶切连接后的分子大小问题
已经有12人回复
- 【求助/交流】关于酶切产物连接的一点问题
已经有13人回复
- 【求助/交流】超大片段连接问题
已经有9人回复
- 【求助/交流】大片段连接转化成功与否问题
已经有11人回复
- 【求助/交流】关于克隆连接
已经有15人回复
gyesang
荣誉版主 (著名写手)
-
专家经验: +24 - MolEPI: 31
- 应助: 599 (博士)
- 贵宾: 2.689
- 金币: 24338.9
- 散金: 1088
- 红花: 88
- 沙发: 2
- 帖子: 2327
- 在线: 623.1小时
- 虫号: 849017
- 注册: 2009-09-16
- 性别: GG
- 专业: 细胞信号转导
- 管辖: 分子生物
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 回帖置顶 2012-12-06 20:08:34
amisking: 金币+5, MolEPI+1, 鼓励 2012-12-06 20:08:42
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 回帖置顶 2012-12-06 20:08:34
amisking: 金币+5, MolEPI+1, 鼓励 2012-12-06 20:08:42
|
楼主的第一个克隆难度的确是蛮大的，第二个还好， 1. 根据你的描述，总是空板，你有没有测试过你转化时用的感受态的效率，因为你是多片段和大片段连接，对感受态效率还是有一定要求的，最好用那种超级感受态细胞转化比较好，因此，你首先测试下你的感受态细胞，同时用个阳性质粒测试你的平板的抗性，你天天收白板，也可能是你用错抗性平板了 2. 对于第一个多片段克隆，片段是不是太多了点，而且你是PCR产物直接酶切，你可以先把片段连上T-载体等中间载体，然后再酶切回收回来，这样保证每一个片段都被充分酶切开，然后再多片段连试试 3.对于第一个多片段连接，楼主是不是也可考虑用Overlap PCR的方法，先把四个片段拼接为一个片段再往载体上连 4. 你大片段连接的过程和体系都是没有问题的，但是你总是连接不上，会不会是所用连接酶有问题？ 5. 不知道楼主大片段连接是，载体单酶切后有没有进行去磷酸化，如果没有的话，连接后，板子上应该会长很多克隆才对，这是载体自连导致的，是板子的问题还是感受态的问题，楼主可以排查一下 [ Last edited by gyesang on 2012-12-19 at 23:57 ] |
2楼2012-12-06 18:19:42
|
首先非常感谢gyesang的热心回帖！一早我就上来看是否有回帖，很欣喜，今天心情比昨天要好多了。下面就您的问题，我一一做个排查： 1. 做过单转质粒的阳性对照，虽然没有每次都有这个阳性对照，但开始的时候是确定过抗性是对的，转质粒效率是没有太大问题的，至于是不是超级感受态我真不敢肯定，用的是全式金的Trans-T1； 2. 对于第一个多片段，四个片段均不是PCR后直接酶切，都是从质粒上酶切下来的...... 其中，前两个700bp左右的是insert，最初也是PCR酶切，但后来也是为了排除PCR酶切可能不完全，所以又先构到T载体中做了酶切回收，而后两个3.6+1.6kb的片段是载体片段中切下来的，所以能确定待连接的片段酶切是完全的； 3. overlap PCR的方法没做过，不知道是否可行，实现起来难度有多大？ 4. 连接酶是NEB的T4，之前订的都被我用完了，所以最近做的这几次是用的新订的一支，可以考虑做个常规的连接排查一下连接酶的问题，先准备订个fermentas的连接酶试试； 5. 您这个问题真是问到我心里去了，这个问题也非常困扰我，载体单酶切后并没有做去磷酸化处理，为何连自连的都没有能？？板子和感受态都有空转质粒载体的对照，确定没问题。那么就是连接酶了。。。 另外，有推荐使用的超级感受态细胞吗？国外品牌的没法进口，但国内的不清楚哪家的感受态做得最好？以前都是做的常规克隆，所以也没遇到过这么多问题，请大家多交流指教了！ |
3楼2012-12-07 08:23:25
gyesang
荣誉版主 (著名写手)
-
专家经验: +24 - MolEPI: 31
- 应助: 599 (博士)
- 贵宾: 2.689
- 金币: 24338.9
- 散金: 1088
- 红花: 88
- 沙发: 2
- 帖子: 2327
- 在线: 623.1小时
- 虫号: 849017
- 注册: 2009-09-16
- 性别: GG
- 专业: 细胞信号转导
- 管辖: 分子生物
【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
|
1. 关于你的第一个克隆，我强烈建议你先用Overlap PCR的方法把片段连好，再往载体上构建，从时间上， 比你在那撞运气式的四片段连接肯定会快很多，主要缺点就是需要合成引物，浪费钱，但为了实验，我们不在乎这点钱 2. 载体单酶切后并没有做去磷酸化处理，且没有自连，而且你的板子和感受态也验证没有问题，那你需要考虑换连接酶了，这里给你个推荐（绝对非广告，因为我们实验室一直用，就是觉的还可以），你可以去查查toyobo公司的ligation high这个连接酶 3. 关于感受态，我没有什么建议的，我们都是实验室自己做的感受态，专门人负责的，可能是经常做的缘故吧，都到了如火纯清的地步了，感受态基本没出现过问题，且好用，至于哪个公司卖，还真不清楚 |
4楼2012-12-08 21:32:10
5楼2013-05-12 10:13:07
6楼2013-05-12 21:41:44
whs1230
新虫 (初入文坛)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 42
- 帖子: 18
- 在线: 16.6小时
- 虫号: 1671017
- 注册: 2012-03-06
- 性别: GG
- 专业: 基因表达调控与表观遗传学
7楼2013-10-30 19:21:12
gyesang
荣誉版主 (著名写手)
-
专家经验: +24 - MolEPI: 31
- 应助: 599 (博士)
- 贵宾: 2.689
- 金币: 24338.9
- 散金: 1088
- 红花: 88
- 沙发: 2
- 帖子: 2327
- 在线: 623.1小时
- 虫号: 849017
- 注册: 2009-09-16
- 性别: GG
- 专业: 细胞信号转导
- 管辖: 分子生物
8楼2013-10-30 22:48:30
 |
9楼2013-10-31 08:57:22
20