| 查看: 1753 | 回复: 5 | ||
wanghx_2012银虫 (小有名气)
|
[求助]
载体和酶切片段连接的问题
|
| 各位朋友,我现在在做重组质粒,用的是PHT304,想要在接头区连接一个Cry3a的启动子,现在我在启动子的上下油分别加了Pst1和Xba1的酶切位点.我用双酶切了T载体和304之后割胶回收了对应大小的片段,然后T4连接过夜转化DH5a,挑抗性平板上长的单菌落做PCR时可以看到微弱的1000bp的条带但是提质粒提出来的DNA远大于重组质粒理论大小.酶切的时候也看不到目标条带.我怀疑是不是有这样的情况:我的启动子自我连接了,然后这个连接体被接到了切开的304上.或则各位朋友有没有什么好的建议.多谢!~ |
回复此楼» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有192人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 求助：Xho 1 单酶切 载体连接
已经有19人回复
- 关于酶切后的连接问题，共同探讨共同进步
已经有18人回复
- 双酶切，连接，转化问题
已经有30人回复
- T载体酶切片段与目的片段大小不一致
已经有12人回复
- 目的片段与表达载体的连接
已经有23人回复
- 连接酶切问题
已经有10人回复
- PCR ， 双酶切，连接问题
已经有17人回复
- 【求助】基因克隆T载体酶切问题等
已经有8人回复
- 酶切的相关问题
已经有7人回复
- 双酶切连接表达载体，两个月都没做出来，问题到底出在哪里呢~？求指点
已经有52人回复
- 为什么我做的酶切连接总是不长斑呢？
已经有24人回复
- 【求助/交流】超大片段连接问题
已经有9人回复
2楼2012-08-22 11:56:37
sd3824289
木虫 (正式写手)
- 应助: 47 (小学生)
- 金币: 2304.1
- 散金: 33
- 帖子: 740
- 在线: 105.5小时
- 虫号: 1657712
- 注册: 2012-03-02
- 专业: 生物化学
3楼2012-08-24 10:20:08
mgangle
铁杆木虫 (著名写手)
乐乐家族-----乐颠颠
- 应助: 16 (小学生)
- 金币: 9313.9
- 散金: 200
- 沙发: 1
- 帖子: 2567
- 在线: 475.8小时
- 虫号: 512931
- 注册: 2008-02-27
- 专业: 植物病理学
【答案】应助回帖
★ ★
wanghx_2012: 金币+2, ★有帮助 2012-08-24 20:52:44
wanghx_2012: 金币+2, ★有帮助 2012-08-24 20:52:44
|
1.PCR扩增有弱条带，但是酶切却没有，原因很可能是没有连接到304载体，因为菌落PCR有时候也会出现假阳性，我们可以简单理解为目的片段只是附着在菌落表面，所以PCR扩增是可以的，但是一旦摇成菌液再PCR检测，可能连弱带也没有了，楼主实在不放心，简单的方法是送去测序就知道有没有连接上了！ 2.质粒与预测大小不一致，质粒正常提取一般会有螺旋，环状等结构，质粒条带的位置变化和这些结构也有一定关系，不能完全说明什么问题！ 所以最简单的方法送去测序，一般一个反应也就25元左右，与酶切花费差不多。 |
4楼2012-08-24 16:25:34
wanghx_2012
银虫 (小有名气)
- 应助: 10 (幼儿园)
- 金币: 377
- 散金: 3
- 红花: 1
- 帖子: 106
- 在线: 9.3小时
- 虫号: 1751313
- 注册: 2012-04-12
- 性别: GG
- 专业: 蛋白质组学
5楼2012-08-24 20:52:04
 |
6楼2012-08-25 23:09:23
