[交流] 关于酶切后的连接问题，共同探讨共同进步

2楼: Originally posted by 张宏宇123 at 2012-05-29 15:41:22
你回收的片段是多大的啊？

3楼: Originally posted by gywyl1977 at 2012-05-29 16:03:08
会有很多可能，先要确保片段和质粒都切开了。然后再考虑连接过程的因素。

6楼: Originally posted by 萝卜丝儿 at 2012-05-29 22:40:07
你说你回收后的浓度低，到底是多少低？还有回收后的片段质量如何？比如A260/280,这个值最好介于1.6-2.0之间，高于2.0是rna污染，低于1.6是蛋白质污染，你片段连接是否是粘性末端或者是平末端，前者效率会比后者高一 ...

11楼: Originally posted by gywyl1977 at 2012-05-30 13:04:10
建议如下： 1）连接体系可以设几个片段的浓度梯度；2）设阳性对照，即转化一个正常的质粒，这是防止你的感受态出问题；3）再不行，检查你的连接酶是否失效等等。

12楼: Originally posted by 蓝心1728 at 2012-05-30 13:50:43
1、如果酶切以后浓度低的话，可以多切几管，并在一起，回收后打开盖子，晾一晚，相当于稍微浓缩下
2、连接前，至少点5微升溶液可以看到条带，虽然连接成败主要看比例，但若浓度太低效果不好
3、连接比例可以按DNA ...

12楼: Originally posted by 蓝心1728 at 2012-05-30 13:50:43
1、如果酶切以后浓度低的话，可以多切几管，并在一起，回收后打开盖子，晾一晚，相当于稍微浓缩下
2、连接前，至少点5微升溶液可以看到条带，虽然连接成败主要看比例，但若浓度太低效果不好
3、连接比例可以按DNA ...

16楼: Originally posted by 蓝心1728 at 2012-06-01 14:55:16
1、连接酶本身是否好用，问问其他老师或同学有没有用过同一管的连接酶能否连上，试试其他牌子的酶
2、比列是按质量比，DNA目的片段：载体=7:1~10:1之间，一般目的片段要多一些，例如，7:1的话，取目的片段（44.5ng ...