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蛋白之家

新虫 (小有名气)

[交流] 关于酶切后的连接问题，共同探讨共同进步

各位大侠
为什么酶切切下来也能回收上，就是回收的时候浓度小，但连了好多次都连不上啊  试过4:1 ，3:1的比例，不是说连接的时候3:1的比例是最好的么  为什么连不上啊   很纠结
希望各位大侠前来帮忙，谢谢!
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1楼 2012-05-29 15:05:57
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

萝卜丝儿

木虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
蛋白之家(金币+1): 谢谢参与
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流 2012-05-30 13:45:51
你说你回收后的浓度低，到底是多少低？还有回收后的片段质量如何？比如A260/280,这个值最好介于1.6-2.0之间，高于2.0是rna污染，低于1.6是蛋白质污染，你片段连接是否是粘性末端或者是平末端，前者效率会比后者高一点，保险起见可以在转化前，把连接酶给灭活，当然一般情况这一步都会跳过，还有片段浓度很低的情况下，连出来就是你的人品了，尽量让你的连接片段浓度高，还有就是，你检查了你的感受态细胞了么？
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6楼2012-05-29 22:40:07
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普通回帖

张宏宇123

金虫 (著名写手)
★
蛋白之家(金币+1): 谢谢参与
你回收的片段是多大的啊？
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2楼2012-05-29 15:41:22
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gywyl1977

木虫 (正式写手)
★
蛋白之家(金币+1): 谢谢参与
会有很多可能，先要确保片段和质粒都切开了。然后再考虑连接过程的因素。
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3楼2012-05-29 16:03:08
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gjs713

至尊木虫 (职业作家)
★
蛋白之家(金币+1): 谢谢参与
试试10:1或以上吧，效果可能会好些
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4楼2012-05-29 20:21:33
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wanlitian2008

金虫 (小有名气)
★
蛋白之家(金币+1): 谢谢参与
你的问题写的不清楚啊，具体一点，或许别人会发现问题的所在
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5楼2012-05-29 20:29:52
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蛋白之家

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 张宏宇123 at 2012-05-29 15:41:22
你回收的片段是多大的啊？

回收的片段是1300左右，载体是4250左右
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7楼2012-05-30 09:28:26
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蛋白之家

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by gywyl1977 at 2012-05-29 16:03:08
会有很多可能，先要确保片段和质粒都切开了。然后再考虑连接过程的因素。

目的片段和质粒都切开了，目的片段的浓度时5ng/μl, 质粒浓度时11ng/μl
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8楼2012-05-30 09:30:22
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蛋白之家

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 萝卜丝儿 at 2012-05-29 22:40:07
你说你回收后的浓度低，到底是多少低？还有回收后的片段质量如何？比如A260/280,这个值最好介于1.6-2.0之间，高于2.0是rna污染，低于1.6是蛋白质污染，你片段连接是否是粘性末端或者是平末端，前者效率会比后者高一 ...

谢谢您的种种提醒
首先回收后的浓度最低的是5ng/μl，最大的也就是质粒浓度时11ng/μl A260/A280均为1.714-1.84之间，连接时粘性末端  
我测了浓度之后按3:1的比例又试过了  做了16个板子，有两个板子上长了菌落
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9楼2012-05-30 09:38:42
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小白虾

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你说的太简洁啦，连接应该是很成熟的
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10楼2012-05-30 12:09:55
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gywyl1977

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-30 13:46:07
建议如下： 1）连接体系可以设几个片段的浓度梯度；2）设阳性对照，即转化一个正常的质粒，这是防止你的感受态出问题；3）再不行，检查你的连接酶是否失效等等。
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11楼2012-05-30 13:04:10
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蓝心1728

木虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
蛋白之家: 回帖置顶 2012-05-30 15:01:11
西瓜: 金币+5, MolEPI+1, Good！ 2012-05-31 09:13:47
1、如果酶切以后浓度低的话，可以多切几管，并在一起，回收后打开盖子，晾一晚，相当于稍微浓缩下
2、连接前，至少点5微升溶液可以看到条带，虽然连接成败主要看比例，但若浓度太低效果不好
3、连接比例可以按DNA片段与载体质量比7:1~10:1间，可以一次多尝试几个比例,增大成功几率
4、连接后转化的感受态效率也很重要，若感受态效率太低也无法得到想要的克隆
5、祝你好运
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蛋白之家
12楼2012-05-30 13:50:43
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蛋白之家

新虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by gywyl1977 at 2012-05-30 13:04:10
建议如下： 1）连接体系可以设几个片段的浓度梯度；2）设阳性对照，即转化一个正常的质粒，这是防止你的感受态出问题；3）再不行，检查你的连接酶是否失效等等。

嗯 好的  谢谢
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13楼2012-05-30 15:00:20
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蛋白之家

新虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 蓝心1728 at 2012-05-30 13:50:43
1、如果酶切以后浓度低的话，可以多切几管，并在一起，回收后打开盖子，晾一晚，相当于稍微浓缩下
2、连接前，至少点5微升溶液可以看到条带，虽然连接成败主要看比例，但若浓度太低效果不好
3、连接比例可以按DNA ...

谢谢  很感谢
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14楼2012-05-30 15:00:39
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蛋白之家

新虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
12楼: Originally posted by 蓝心1728 at 2012-05-30 13:50:43
1、如果酶切以后浓度低的话，可以多切几管，并在一起，回收后打开盖子，晾一晚，相当于稍微浓缩下
2、连接前，至少点5微升溶液可以看到条带，虽然连接成败主要看比例，但若浓度太低效果不好
3、连接比例可以按DNA ...

这次我又重新做了  载体浓度为43.5和17.5 ng/ul   目的片段浓度为分别为12  44.5  16 ng/ul
我按着摩尔数比  载体:目的=1:3  1:2  1:9 的比例又连接了   体系是10ul   可是就是连不上啊   做的对照是用现成的质粒  现成质粒的板子上有菌落   其他的都没有   很郁闷  麻烦您给分析一下
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15楼2012-06-01 09:39:42
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蓝心1728

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
1、连接酶本身是否好用，问问其他老师或同学有没有用过同一管的连接酶能否连上，试试其他牌子的酶
2、比列是按质量比，DNA目的片段：载体=7:1~10:1之间，一般目的片段要多一些，例如，7:1的话，取目的片段（44.5ng/微升）7 微升，加载体（43.5ng/微升）1 微升。具体的还应该按照你的反应体系来进行换算。
3、连接的温度和条件，我们一般用NEB的酶，16℃，连接过夜，时间久点也没关系
4、实验就是这样，如果不遇到问题觉得还蛮简单的，若是出现问题就得一项一项找原因，做的多了，就会越做越顺，不要灰心，加油！
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16楼2012-06-01 14:55:16
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蛋白之家

新虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by 蓝心1728 at 2012-06-01 14:55:16
1、连接酶本身是否好用，问问其他老师或同学有没有用过同一管的连接酶能否连上，试试其他牌子的酶
2、比列是按质量比，DNA目的片段：载体=7:1~10:1之间，一般目的片段要多一些，例如，7:1的话，取目的片段（44.5ng ...

我酶切之后回收的目的片段的浓度才12ng/ul   载体 一个是43  一个是17.5ng/ul 这样也可以做连接吗？  这是我做的酶切之后回收最好的一次浓度了
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17楼2012-06-02 13:28:44
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蓝心1728

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
可以试试看
你可以尝试7:1的比例，如目的片段（12ng/ul ）8微升+载体（17.5ng/ul ）0.8微升；11:1的比例，如如目的片段（12ng/ul ）8微升+载体（17.5ng/ul ）0.5微升
也可以自己调整几个浓度，试试。另外你的感受态效率怎么样？一般连接产物转化时，感受态效率至少10的六次方以上，否则不容易筛选的到
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18楼2012-06-03 15:17:54
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a13515517892

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
浓度太低，可以去浓缩一下，连接的比例先要看是粘性末端还是平滑末端了，各种比例的都有成功的例子，要自己去尝试
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19楼2012-06-27 10:01:26
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