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蛋白之家

新虫 (小有名气)


[交流] 关于酶切后的连接问题,共同探讨共同进步

各位大侠
为什么酶切切下来也能回收上,就是回收的时候浓度小,但连了好多次都连不上啊  试过4:1 ,3:1的比例,不是说连接的时候3:1的比例是最好的么  为什么连不上啊   很纠结
希望各位大侠前来帮忙,谢谢!
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蓝心1728

木虫 (小有名气)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
1、连接酶本身是否好用,问问其他老师或同学有没有用过同一管的连接酶能否连上,试试其他牌子的酶
2、比列是按质量比,DNA目的片段:载体=7:1~10:1之间,一般目的片段要多一些,例如,7:1的话,取目的片段(44.5ng/微升)7 微升,加载体(43.5ng/微升)1 微升。具体的还应该按照你的反应体系来进行换算。
3、连接的温度和条件,我们一般用NEB的酶,16℃,连接过夜,时间久点也没关系
4、实验就是这样,如果不遇到问题觉得还蛮简单的,若是出现问题就得一项一项找原因,做的多了,就会越做越顺,不要灰心,加油!
16楼2012-06-01 14:55:16
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张宏宇123

金虫 (著名写手)



蛋白之家(金币+1): 谢谢参与
你回收的片段是多大的啊?
2楼2012-05-29 15:41:22
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gywyl1977

木虫 (正式写手)



蛋白之家(金币+1): 谢谢参与
会有很多可能,先要确保片段和质粒都切开了。然后再考虑连接过程的因素。
3楼2012-05-29 16:03:08
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gjs713

至尊木虫 (职业作家)



蛋白之家(金币+1): 谢谢参与
试试10:1或以上吧,效果可能会好些
4楼2012-05-29 20:21:33
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