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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 存档旧帖 » 关于酶切后的连接问题，共同探讨共同进步
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蛋白之家

新虫 (小有名气)

[交流] 关于酶切后的连接问题，共同探讨共同进步

各位大侠
为什么酶切切下来也能回收上，就是回收的时候浓度小，但连了好多次都连不上啊  试过4:1 ，3:1的比例，不是说连接的时候3:1的比例是最好的么  为什么连不上啊   很纠结
希望各位大侠前来帮忙，谢谢!
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1楼 2012-05-29 15:05:57
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蓝心1728

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
1、连接酶本身是否好用，问问其他老师或同学有没有用过同一管的连接酶能否连上，试试其他牌子的酶
2、比列是按质量比，DNA目的片段：载体=7:1~10:1之间，一般目的片段要多一些，例如，7:1的话，取目的片段（44.5ng/微升）7 微升，加载体（43.5ng/微升）1 微升。具体的还应该按照你的反应体系来进行换算。
3、连接的温度和条件，我们一般用NEB的酶，16℃，连接过夜，时间久点也没关系
4、实验就是这样，如果不遇到问题觉得还蛮简单的，若是出现问题就得一项一项找原因，做的多了，就会越做越顺，不要灰心，加油！
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16楼2012-06-01 14:55:16
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张宏宇123

金虫 (著名写手)
★
蛋白之家(金币+1): 谢谢参与
你回收的片段是多大的啊？
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2楼2012-05-29 15:41:22
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gywyl1977

木虫 (正式写手)
★
蛋白之家(金币+1): 谢谢参与
会有很多可能，先要确保片段和质粒都切开了。然后再考虑连接过程的因素。
赞一下 回复此楼
3楼2012-05-29 16:03:08
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gjs713

至尊木虫 (职业作家)
★
蛋白之家(金币+1): 谢谢参与
试试10:1或以上吧，效果可能会好些
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4楼2012-05-29 20:21:33
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