24小时热门版块排行榜    

查看: 1781  |  回复: 4
本帖产生 1 个 博学EPI ,点击这里进行查看

woaiqiang

银虫 (初入文坛)

[求助] 单酶切连接的问题

我是用XbaI单酶切PMD-19载体,将我的两端都是XbaI酶切位点的pcr产物连接上去,但是做了很久,一直都是T载体自连,没有将我的目的基因连接进去,请问高手到底应该怎么处理,注意哪些方面,非常感谢,急啊!!!

» 猜你喜欢

已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

liaotiantian

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

woaiqiang(金币+2, 博学EPI+1): 谢谢,还有问题要问 2011-11-11 11:08:33
1确认连接体系没有问题。
2 确认设计引物的时候两边酶切位点的碱基和保护碱基没有问题。
3 考虑PCR产物回收产物浓度提高一点。
连T一般很容易的,我也做的单酶切连接,祝成功啦。
2楼2011-11-10 14:57:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

woaiqiang

银虫 (初入文坛)

1.我的连接体系是10微升,加1微升缓冲液,1微升T载体,7微升我的pcr产物,还有1微升的酶,T载体和pcr产物浓度比为1比7-10左右,都做过,可是挑出的单菌落都是自连了。
2.我的酶切位点是XbaI,两端加的保护碱基是GC,根据保护位点的要求加上去的
3.浓一点的话载体和产物浓度比大约是多少
请详细的说下你做过的单酶切可以么,想知道我的问题到底出在哪里,非常感谢!
3楼2011-11-11 11:08:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

liaotiantian

铜虫 (小有名气)

我用过HindIII和BamHI单酶切位点,takara的pMD 19-T .
我的PCR产物回收洗脱用允许体积的最小体积15微升。
连接体系10微升
PCR产物4.5 微升
T载体  0.5微升
solution I 微升
16℃ 连接过夜
4楼2011-11-11 13:20:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

qiangzhi

新虫 (初入文坛)

Dephosphorylation of the digested vector is essential to eliminate
self-ligation.
5楼2012-03-01 11:28:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 woaiqiang 的主题更新
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 一志愿郑大材料学硕298分,求调剂 +5 wsl111 2026-03-01 5/250 2026-03-01 23:45 by 暮雨星晴
[考研] 江苏省农科院招调剂1名 +3 Qwertyuop 2026-03-01 3/150 2026-03-01 23:18 by aaadim
[考研] 0856调剂 +5 刘梦微 2026-02-28 5/250 2026-03-01 22:30 by wang_dand
[考研] 26考研报考西工大材料308分求调剂 +3 weizhong123 2026-03-01 3/150 2026-03-01 21:42 by 公瑾逍遥
[考研] 272求调剂 +6 田智友 2026-02-28 6/300 2026-03-01 21:40 by 公瑾逍遥
[考研] 0805总分292,求调剂 +7 幻想之殇 2026-03-01 7/350 2026-03-01 21:22 by 公瑾逍遥
[考研] 299求调剂 +3 Y墨明棋妙Y 2026-02-28 5/250 2026-03-01 21:01 by tangxiaotian
[考研] 0856化工专硕求调剂 +12 董boxing 2026-03-01 12/600 2026-03-01 19:45 by 材子momo
[考研] 272求调剂 +6 材紫有化 2026-02-28 6/300 2026-03-01 18:58 by 18137688336
[考研] 291分工科求调剂 +9 science饿饿 2026-03-01 10/500 2026-03-01 18:55 by 18137688336
[考研] 295求调剂 +7 19171856320 2026-02-28 7/350 2026-03-01 18:54 by 18137688336
[考研] 328求调剂 +3 aaadim 2026-03-01 5/250 2026-03-01 17:29 by njzyff
[考研] 化工专硕348,一志愿985求调剂 +5 弗格个 2026-02-28 8/400 2026-03-01 17:25 by sunny81
[考研] 290求调剂 +9 材料专硕调剂; 2026-02-28 11/550 2026-03-01 17:21 by sunny81
[考研] 285求调剂 +8 满头大汗的学生 2026-02-28 8/400 2026-03-01 16:47 by caszguilin
[基金申请] 刚录用,没有期刊号,但是在线可看的论文可以放为代表作吗 10+3 arang1 2026-03-01 3/150 2026-03-01 16:43 by babero
[考研] 303求调剂 +4 今夏不夏 2026-03-01 4/200 2026-03-01 14:46 by 嘟嘟小浣熊
[考研] 295复试调剂 +3 简木ChuFront 2026-03-01 3/150 2026-03-01 14:27 by zzxw520th
[考博] 博士自荐 +4 kkluvs 2026-02-28 4/200 2026-03-01 10:19 by 馥安馥安
[基金申请] 面上模板改不了页边距吧? +5 ieewxg 2026-02-25 6/300 2026-03-01 00:10 by addressing
信息提示
请填处理意见