应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台» 网络生活区» 有奖问答 » 有奖问答完结子版 » 单酶切连接的问题
51/1返回列表
查看: 1781  |  回复: 4
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 1 个 博学EPI ，点击这里进行查看

woaiqiang

银虫 (初入文坛)

[求助] 单酶切连接的问题

我是用XbaI单酶切PMD-19载体，将我的两端都是XbaI酶切位点的pcr产物连接上去，但是做了很久，一直都是T载体自连，没有将我的目的基因连接进去，请问高手到底应该怎么处理，注意哪些方面，非常感谢，急啊！！！
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2011-11-10 09:55:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

liaotiantian

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

woaiqiang(金币+2, 博学EPI+1): 谢谢，还有问题要问 2011-11-11 11:08:33
1确认连接体系没有问题。
2 确认设计引物的时候两边酶切位点的碱基和保护碱基没有问题。
3 考虑PCR产物回收产物浓度提高一点。
连T一般很容易的，我也做的单酶切连接，祝成功啦。
赞一下 回复此楼
2楼2011-11-10 14:57:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

woaiqiang

银虫 (初入文坛)
1.我的连接体系是10微升，加1微升缓冲液，1微升T载体，7微升我的pcr产物，还有1微升的酶，T载体和pcr产物浓度比为1比7-10左右，都做过，可是挑出的单菌落都是自连了。
2.我的酶切位点是XbaI，两端加的保护碱基是GC，根据保护位点的要求加上去的
3.浓一点的话载体和产物浓度比大约是多少
请详细的说下你做过的单酶切可以么，想知道我的问题到底出在哪里，非常感谢！
赞一下 回复此楼
3楼2011-11-11 11:08:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

liaotiantian

铜虫 (小有名气)
我用过HindIII和BamHI单酶切位点，takara的pMD 19-T .
我的PCR产物回收洗脱用允许体积的最小体积15微升。
连接体系10微升
PCR产物4.5 微升
T载体  0.5微升
solution I 微升
16℃ 连接过夜
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2011-11-11 13:20:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

qiangzhi

新虫 (初入文坛)
Dephosphorylation of the digested vector is essential to eliminate
self-ligation.
赞一下 回复此楼
5楼2012-03-01 11:28:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 woaiqiang 的主题更新
51/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 一志愿郑大材料学硕298分，求调剂 +5 wsl111 2026-03-01 5/250 2026-03-01 23:45 by 暮雨星晴
[考研] 江苏省农科院招调剂1名 +3 Qwertyuop 2026-03-01 3/150 2026-03-01 23:18 by aaadim
[考研] 0856调剂 +5 刘梦微 2026-02-28 5/250 2026-03-01 22:30 by wang_dand
[考研] 26考研报考西工大材料308分求调剂 +3 weizhong123 2026-03-01 3/150 2026-03-01 21:42 by 公瑾逍遥
[考研] 272求调剂 +6 田智友 2026-02-28 6/300 2026-03-01 21:40 by 公瑾逍遥
[考研] 0805总分292，求调剂 +7 幻想之殇 2026-03-01 7/350 2026-03-01 21:22 by 公瑾逍遥
[考研] 299求调剂 +3 Y墨明棋妙Y 2026-02-28 5/250 2026-03-01 21:01 by tangxiaotian
[考研] 0856化工专硕求调剂 +12 董boxing 2026-03-01 12/600 2026-03-01 19:45 by 材子momo
[考研] 272求调剂 +6 材紫有化 2026-02-28 6/300 2026-03-01 18:58 by 18137688336
[考研] 291分工科求调剂 +9 science饿饿 2026-03-01 10/500 2026-03-01 18:55 by 18137688336
[考研] 295求调剂 +7 19171856320 2026-02-28 7/350 2026-03-01 18:54 by 18137688336
[考研] 328求调剂 +3 aaadim 2026-03-01 5/250 2026-03-01 17:29 by njzyff
[考研] 化工专硕348，一志愿985求调剂 +5 弗格个 2026-02-28 8/400 2026-03-01 17:25 by sunny81
[考研] 290求调剂 +9 材料专硕调剂； 2026-02-28 11/550 2026-03-01 17:21 by sunny81
[考研] 285求调剂 +8 满头大汗的学生 2026-02-28 8/400 2026-03-01 16:47 by caszguilin
[基金申请] 刚录用，没有期刊号，但是在线可看的论文可以放为代表作吗 10+3 arang1 2026-03-01 3/150 2026-03-01 16:43 by babero
[考研] 303求调剂 +4 今夏不夏 2026-03-01 4/200 2026-03-01 14:46 by 嘟嘟小浣熊
[考研] 295复试调剂 +3 简木ChuFront 2026-03-01 3/150 2026-03-01 14:27 by zzxw520th
[考博] 博士自荐 +4 kkluvs 2026-02-28 4/200 2026-03-01 10:19 by 馥安馥安
[基金申请] 面上模板改不了页边距吧？ +5 ieewxg 2026-02-25 6/300 2026-03-01 00:10 by addressing
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭