应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台» 网络生活区» 有奖问答 » 有奖问答完结子版 » 单酶切连接的问题
51/1返回列表
查看: 1789  |  回复: 4
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 1 个 博学EPI ，点击这里进行查看

woaiqiang

银虫 (初入文坛)

[求助] 单酶切连接的问题

我是用XbaI单酶切PMD-19载体，将我的两端都是XbaI酶切位点的pcr产物连接上去，但是做了很久，一直都是T载体自连，没有将我的目的基因连接进去，请问高手到底应该怎么处理，注意哪些方面，非常感谢，急啊！！！
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2011-11-10 09:55:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

liaotiantian

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

woaiqiang(金币+2, 博学EPI+1): 谢谢，还有问题要问 2011-11-11 11:08:33
1确认连接体系没有问题。
2 确认设计引物的时候两边酶切位点的碱基和保护碱基没有问题。
3 考虑PCR产物回收产物浓度提高一点。
连T一般很容易的，我也做的单酶切连接，祝成功啦。
赞一下 回复此楼
2楼2011-11-10 14:57:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

woaiqiang

银虫 (初入文坛)
1.我的连接体系是10微升，加1微升缓冲液，1微升T载体，7微升我的pcr产物，还有1微升的酶，T载体和pcr产物浓度比为1比7-10左右，都做过，可是挑出的单菌落都是自连了。
2.我的酶切位点是XbaI，两端加的保护碱基是GC，根据保护位点的要求加上去的
3.浓一点的话载体和产物浓度比大约是多少
请详细的说下你做过的单酶切可以么，想知道我的问题到底出在哪里，非常感谢！
赞一下 回复此楼
3楼2011-11-11 11:08:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

liaotiantian

铜虫 (小有名气)
我用过HindIII和BamHI单酶切位点，takara的pMD 19-T .
我的PCR产物回收洗脱用允许体积的最小体积15微升。
连接体系10微升
PCR产物4.5 微升
T载体  0.5微升
solution I 微升
16℃ 连接过夜
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2011-11-11 13:20:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

qiangzhi

新虫 (初入文坛)
Dephosphorylation of the digested vector is essential to eliminate
self-ligation.
赞一下 回复此楼
5楼2012-03-01 11:28:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 woaiqiang 的主题更新
51/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 286求调剂 +10 Faune 2026-03-21 10/500 2026-03-21 23:34 by 314126402
[考研] 328求调剂，英语六级551，有科研经历 +5 生物工程调剂 2026-03-17 9/450 2026-03-21 23:32 by zhujy1982
[考研] 326求调剂 +5 诺贝尔化学奖觊� 2026-03-15 8/400 2026-03-21 19:33 by ColorlessPI
[考研] 302求调剂 +12 呼呼呼。。。。 2026-03-17 12/600 2026-03-21 17:29 by ColorlessPI
[考研] 求调剂 +3 白QF 2026-03-21 3/150 2026-03-21 13:12 by zhukairuo
[考研] 310求调剂 +3 baibai1314 2026-03-16 3/150 2026-03-21 03:56 by JourneyLucky
[考研] 机械专硕299求调剂至材料 +3 kkcoco25 2026-03-16 4/200 2026-03-21 03:52 by JourneyLucky
[考研] 265求调剂 +9 梁梁校校 2026-03-17 9/450 2026-03-21 02:17 by JourneyLucky
[考研] 294求调剂材料与化工专硕 +15 陌の森林 2026-03-18 15/750 2026-03-20 23:28 by JourneyLucky
[考研] 一志愿中海洋材料工程专硕330分求调剂 +8 小材化本科 2026-03-18 8/400 2026-03-20 23:16 by JourneyLucky
[考研] A区线材料学调剂 +5 周周无极 2026-03-20 5/250 2026-03-20 21:33 by laoshidan
[考研] 一志愿武理材料工程348求调剂 +3 ￣^￣゜汗 2026-03-19 4/200 2026-03-20 21:01 by zhukairuo
[考博] 招收博士1-2人 +3 QGZDSYS 2026-03-18 3/150 2026-03-20 11:58 by 呱呱呱呱叫
[考研] 求调剂 +3 暗涌afhb 2026-03-16 3/150 2026-03-20 00:28 by 河南大学校友
[考研] 0854可跨调剂，一作一项核心论文五项专利，省、国级证书40+数一英一287 +8 小李0854 2026-03-16 8/400 2026-03-18 14:35 by 搏击518
[考研] 生物学071000 329分求调剂 +3 我爱生物生物爱� 2026-03-17 3/150 2026-03-18 10:12 by macy2011
[硕博家园] 湖北工业大学 生命科学与健康学院-课题组招收2026级食品/生物方向硕士 +3 1喜春8 2026-03-17 5/250 2026-03-17 17:18 by ber川cool子
[考研] 085601求调剂 +4 Du.11 2026-03-16 4/200 2026-03-17 17:08 by ruiyingmiao
[考研] 一志愿，福州大学材料专硕339分求调剂 +3 木子momo青争 2026-03-15 3/150 2026-03-17 07:52 by laoshidan
[考研] 东南大学364求调剂 +5 JasonYuiui 2026-03-15 5/250 2026-03-16 21:28 by 木瓜膏
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭