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woaiqiang

银虫 (初入文坛)

[求助] 单酶切连接的问题

我是用XbaI单酶切PMD-19载体，将我的两端都是XbaI酶切位点的pcr产物连接上去，但是做了很久，一直都是T载体自连，没有将我的目的基因连接进去，请问高手到底应该怎么处理，注意哪些方面，非常感谢，急啊！！！
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1楼 2011-11-10 09:55:23
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liaotiantian

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

woaiqiang(金币+2, 博学EPI+1): 谢谢，还有问题要问 2011-11-11 11:08:33
1确认连接体系没有问题。
2 确认设计引物的时候两边酶切位点的碱基和保护碱基没有问题。
3 考虑PCR产物回收产物浓度提高一点。
连T一般很容易的，我也做的单酶切连接，祝成功啦。
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2楼2011-11-10 14:57:42
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woaiqiang

银虫 (初入文坛)
1.我的连接体系是10微升，加1微升缓冲液，1微升T载体，7微升我的pcr产物，还有1微升的酶，T载体和pcr产物浓度比为1比7-10左右，都做过，可是挑出的单菌落都是自连了。
2.我的酶切位点是XbaI，两端加的保护碱基是GC，根据保护位点的要求加上去的
3.浓一点的话载体和产物浓度比大约是多少
请详细的说下你做过的单酶切可以么，想知道我的问题到底出在哪里，非常感谢！
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3楼2011-11-11 11:08:35
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liaotiantian

铜虫 (小有名气)
我用过HindIII和BamHI单酶切位点，takara的pMD 19-T .
我的PCR产物回收洗脱用允许体积的最小体积15微升。
连接体系10微升
PCR产物4.5 微升
T载体  0.5微升
solution I 微升
16℃ 连接过夜
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4楼2011-11-11 13:20:53
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qiangzhi

新虫 (初入文坛)
Dephosphorylation of the digested vector is essential to eliminate
self-ligation.
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5楼2012-03-01 11:28:34
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