应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 存档旧帖 » 关于酶切后的连接问题，共同探讨共同进步
191/1返回列表
查看: 2503  |  回复: 18
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看

蛋白之家

新虫 (小有名气)

[交流] 关于酶切后的连接问题，共同探讨共同进步

各位大侠
为什么酶切切下来也能回收上，就是回收的时候浓度小，但连了好多次都连不上啊  试过4:1 ，3:1的比例，不是说连接的时候3:1的比例是最好的么  为什么连不上啊   很纠结
希望各位大侠前来帮忙，谢谢!
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼 2012-05-29 15:05:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

萝卜丝儿

木虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
蛋白之家(金币+1): 谢谢参与
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流 2012-05-30 13:45:51
你说你回收后的浓度低，到底是多少低？还有回收后的片段质量如何？比如A260/280,这个值最好介于1.6-2.0之间，高于2.0是rna污染，低于1.6是蛋白质污染，你片段连接是否是粘性末端或者是平末端，前者效率会比后者高一点，保险起见可以在转化前，把连接酶给灭活，当然一般情况这一步都会跳过，还有片段浓度很低的情况下，连出来就是你的人品了，尽量让你的连接片段浓度高，还有就是，你检查了你的感受态细胞了么？
赞一下(1人) 回复此楼
6楼2012-05-29 22:40:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

张宏宇123

金虫 (著名写手)
★
蛋白之家(金币+1): 谢谢参与
你回收的片段是多大的啊？
赞一下 回复此楼
2楼2012-05-29 15:41:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gywyl1977

木虫 (正式写手)
★
蛋白之家(金币+1): 谢谢参与
会有很多可能，先要确保片段和质粒都切开了。然后再考虑连接过程的因素。
赞一下 回复此楼
3楼2012-05-29 16:03:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gjs713

至尊木虫 (职业作家)
★
蛋白之家(金币+1): 谢谢参与
试试10:1或以上吧，效果可能会好些
赞一下 回复此楼
4楼2012-05-29 20:21:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wanlitian2008

金虫 (小有名气)
★
蛋白之家(金币+1): 谢谢参与
你的问题写的不清楚啊，具体一点，或许别人会发现问题的所在
赞一下 回复此楼
5楼2012-05-29 20:29:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

蛋白之家

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 张宏宇123 at 2012-05-29 15:41:22
你回收的片段是多大的啊？

回收的片段是1300左右，载体是4250左右
赞一下 回复此楼
7楼2012-05-30 09:28:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

蛋白之家

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by gywyl1977 at 2012-05-29 16:03:08
会有很多可能，先要确保片段和质粒都切开了。然后再考虑连接过程的因素。

目的片段和质粒都切开了，目的片段的浓度时5ng/μl, 质粒浓度时11ng/μl
赞一下 回复此楼
8楼2012-05-30 09:30:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

蛋白之家

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 萝卜丝儿 at 2012-05-29 22:40:07
你说你回收后的浓度低，到底是多少低？还有回收后的片段质量如何？比如A260/280,这个值最好介于1.6-2.0之间，高于2.0是rna污染，低于1.6是蛋白质污染，你片段连接是否是粘性末端或者是平末端，前者效率会比后者高一 ...

谢谢您的种种提醒
首先回收后的浓度最低的是5ng/μl，最大的也就是质粒浓度时11ng/μl A260/A280均为1.714-1.84之间，连接时粘性末端  
我测了浓度之后按3:1的比例又试过了  做了16个板子，有两个板子上长了菌落
赞一下 回复此楼
9楼2012-05-30 09:38:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小白虾

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你说的太简洁啦，连接应该是很成熟的
赞一下 回复此楼
10楼2012-05-30 12:09:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gywyl1977

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-30 13:46:07
建议如下： 1）连接体系可以设几个片段的浓度梯度；2）设阳性对照，即转化一个正常的质粒，这是防止你的感受态出问题；3）再不行，检查你的连接酶是否失效等等。
赞一下 回复此楼
11楼2012-05-30 13:04:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

蓝心1728

木虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
蛋白之家: 回帖置顶 2012-05-30 15:01:11
西瓜: 金币+5, MolEPI+1, Good！ 2012-05-31 09:13:47
1、如果酶切以后浓度低的话，可以多切几管，并在一起，回收后打开盖子，晾一晚，相当于稍微浓缩下
2、连接前，至少点5微升溶液可以看到条带，虽然连接成败主要看比例，但若浓度太低效果不好
3、连接比例可以按DNA片段与载体质量比7:1~10:1间，可以一次多尝试几个比例,增大成功几率
4、连接后转化的感受态效率也很重要，若感受态效率太低也无法得到想要的克隆
5、祝你好运
赞一下 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

蛋白之家
12楼2012-05-30 13:50:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

蛋白之家

新虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by gywyl1977 at 2012-05-30 13:04:10
建议如下： 1）连接体系可以设几个片段的浓度梯度；2）设阳性对照，即转化一个正常的质粒，这是防止你的感受态出问题；3）再不行，检查你的连接酶是否失效等等。

嗯 好的  谢谢
回复此楼
13楼2012-05-30 15:00:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

蛋白之家

新虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 蓝心1728 at 2012-05-30 13:50:43
1、如果酶切以后浓度低的话，可以多切几管，并在一起，回收后打开盖子，晾一晚，相当于稍微浓缩下
2、连接前，至少点5微升溶液可以看到条带，虽然连接成败主要看比例，但若浓度太低效果不好
3、连接比例可以按DNA ...

谢谢  很感谢
回复此楼
14楼2012-05-30 15:00:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

蛋白之家

新虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
12楼: Originally posted by 蓝心1728 at 2012-05-30 13:50:43
1、如果酶切以后浓度低的话，可以多切几管，并在一起，回收后打开盖子，晾一晚，相当于稍微浓缩下
2、连接前，至少点5微升溶液可以看到条带，虽然连接成败主要看比例，但若浓度太低效果不好
3、连接比例可以按DNA ...

这次我又重新做了  载体浓度为43.5和17.5 ng/ul   目的片段浓度为分别为12  44.5  16 ng/ul
我按着摩尔数比  载体:目的=1:3  1:2  1:9 的比例又连接了   体系是10ul   可是就是连不上啊   做的对照是用现成的质粒  现成质粒的板子上有菌落   其他的都没有   很郁闷  麻烦您给分析一下
赞一下 回复此楼
15楼2012-06-01 09:39:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

蓝心1728

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
1、连接酶本身是否好用，问问其他老师或同学有没有用过同一管的连接酶能否连上，试试其他牌子的酶
2、比列是按质量比，DNA目的片段：载体=7:1~10:1之间，一般目的片段要多一些，例如，7:1的话，取目的片段（44.5ng/微升）7 微升，加载体（43.5ng/微升）1 微升。具体的还应该按照你的反应体系来进行换算。
3、连接的温度和条件，我们一般用NEB的酶，16℃，连接过夜，时间久点也没关系
4、实验就是这样，如果不遇到问题觉得还蛮简单的，若是出现问题就得一项一项找原因，做的多了，就会越做越顺，不要灰心，加油！
赞一下 回复此楼
16楼2012-06-01 14:55:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

蛋白之家

新虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by 蓝心1728 at 2012-06-01 14:55:16
1、连接酶本身是否好用，问问其他老师或同学有没有用过同一管的连接酶能否连上，试试其他牌子的酶
2、比列是按质量比，DNA目的片段：载体=7:1~10:1之间，一般目的片段要多一些，例如，7:1的话，取目的片段（44.5ng ...

我酶切之后回收的目的片段的浓度才12ng/ul   载体 一个是43  一个是17.5ng/ul 这样也可以做连接吗？  这是我做的酶切之后回收最好的一次浓度了
赞一下 回复此楼
17楼2012-06-02 13:28:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

蓝心1728

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
可以试试看
你可以尝试7:1的比例，如目的片段（12ng/ul ）8微升+载体（17.5ng/ul ）0.8微升；11:1的比例，如如目的片段（12ng/ul ）8微升+载体（17.5ng/ul ）0.5微升
也可以自己调整几个浓度，试试。另外你的感受态效率怎么样？一般连接产物转化时，感受态效率至少10的六次方以上，否则不容易筛选的到
赞一下 回复此楼
18楼2012-06-03 15:17:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

a13515517892

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
浓度太低，可以去浓缩一下，连接的比例先要看是粘性末端还是平滑末端了，各种比例的都有成功的例子，要自己去尝试
赞一下 回复此楼
19楼2012-06-27 10:01:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 蛋白之家 的主题更新
191/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 一志愿211，化学学硕，310分，本科重点双非，求调剂 +25 努力奋斗112 2026-04-07 28/1400 2026-04-10 12:23 by pengliang8036
[考研] 288求调剂 +12 代fish 2026-04-09 12/600 2026-04-10 11:57 by jxlabyan
[考研] 298求调剂 +8 钉叮咚冬瓜 2026-04-07 10/500 2026-04-10 11:25 by 高维春
[考研] 求调剂 +16 熊二想上岸 2026-04-04 16/800 2026-04-10 11:24 by may_新宇
[考研] 本科211 工科085400 280分求调剂 可跨专业 +3 LZH（等待调剂中 2026-04-09 3/150 2026-04-09 21:29 by wutongshun
[考研] 291分调剂 +3 上岸小莹加油 2026-04-09 4/200 2026-04-09 17:28 by 1753564080
[考研] 085600材料与化工，求调剂 +11 won_qii 2026-04-07 11/550 2026-04-09 17:03 by luoyongfeng
[考研] 291求调剂 +7 关忆北. 2026-04-09 8/400 2026-04-09 15:17 by 探123
[考研] 材料与化工专硕306分找合适调剂 +27 沧海轻舟e 2026-04-06 28/1400 2026-04-08 22:06 by wdyheheeh
[考研] 材料考研求调剂总分280 +30 mkjlz1 2026-04-06 35/1750 2026-04-08 21:25 by cyh—315
[考研] 320分人工智能调剂 +9 振—TZ 2026-04-03 10/500 2026-04-08 19:56 by 振—TZ
[考研] 求调剂 +11 wwwwabcde 2026-04-07 11/550 2026-04-07 23:16 by JourneyLucky
[考研] 305分求调剂 +3 哈_哈_哈_哈_哈 2026-04-04 5/250 2026-04-07 14:49 by 哈_哈_哈_哈_哈
[考研] 0854求调剂 +9 亨氏番茄沙司 2026-04-06 10/500 2026-04-07 14:37 by shdgaomin
[考研] 285求调剂 +8 AZMK 2026-04-04 11/550 2026-04-06 13:56 by BruceLiu320
[考研] 346分的生物与医药08600求调剂 +6 常雨阳上岸 2026-04-05 7/350 2026-04-06 12:36 by lys0704
[考研] 求调剂 +11 xzghyuj 2026-04-04 11/550 2026-04-06 11:49 by lijunpoly
[考研] 315求调剂 +5 ＆123456789 2026-04-05 5/250 2026-04-05 19:55 by nepu_uu
[考研] 348求调剂 +6 wukira 2026-04-04 6/300 2026-04-05 18:11 by 猪会飞
[考研] 387求调剂 +4 爱吃片豆土 2026-04-03 5/250 2026-04-04 08:10 by 岸上的一条鱼
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭