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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于酶切连接转化的问题
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丫头7976

铜虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】关于酶切连接转化的问题

大家好，我最近在做酶切，连接，转化，载体是PET-30a大概5420bp 进行了双酶切，切胶纯化，目的片段是300bp双酶切切胶纯化，纯化后i跑了电泳，亮度跟marker差不多，连接时我是目的片段与载体各1ul，酶1ul，6ul体系，和25ul体系都做过，只是做转化时平板都没有长菌，最可能的原因就是没连上吧，还有连接时的目的片段与载体的摩尔比是3-10:1，我不知道这个该怎么算，换算成体积该怎么加，请做过酶切连接并转化的有经验的大侠指教，我将不胜感激。诸位新年快乐，心想事成。
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1楼2011-01-01 17:15:59
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
★ ★
dhd997(金币+2):good，希望你继续加油哦，这几天出台下次VIP奖励制度 2011-01-01 21:20:40
丫头7976(金币+2): 2011-01-02 08:56:41
http://www.promega.com/tbs/9pim180/9pim180.pdf

看看这个里面的摩尔数怎么计算吧。没必要做25ul那么大的连接体系。

至于体积，那是和你的DNA浓度相关的。

你确定感受态、及酶切都不存在问题么？
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2楼2011-01-01 17:30:25
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
还有就是连接酶用的哪家的？
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3楼2011-01-01 17:31:01
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天使托

专家顾问 (职业作家)
★ ★
dhd997(金币+2):good，希望你继续加油哦，这几天出台下次VIP奖励制度 2011-01-01 21:21:01
丫头7976(金币+2): 2011-01-02 08:58:57
什么叫跟marker一般亮？你没有做过定量吗？就是把你酶切纯化以后的质粒和基因定量，然后再确定连接的量，不过连接我们一般都是10ul的量，目的基因量多一些，如果没有长的话那肯定就是没有连接上了，不过连接时间可以稍微长一些，虽说会出现假阳性，但是你可以用pcr快速验证一下滴！祝实验顺利！
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4楼2011-01-01 18:14:29
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天使托

专家顾问 (职业作家)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2011-01-01 17:30:25:
http://www.promega.com/tbs/9pim180/9pim180.pdf

看看这个里面的摩尔数怎么计算吧。没必要做25ul那么大的连接体系。

至于体积，那是和你的DNA浓度相关的。

你确定感受态、及酶切都不存在问题 ...

普洛麦格的说明可以参考一下，不过并不总是这样子的！
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5楼2011-01-01 18:15:51
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srlee

铁杆木虫 (小有名气)
丫头7976(金币+1):谢谢啊 2011-01-02 09:08:20
引用回帖:
Originally posted by 丫头7976 at 2011-01-01 17:15:59:
大家好，我最近在做酶切，连接，转化，载体是PET-30a大概5420bp 进行了双酶切，切胶纯化，目的片段是300bp双酶切切胶纯化，纯化后i跑了电泳，亮度跟marker差不多，连接时我是目的片段与载体各1ul，酶1ul，6ul体系 ...

这又是大载体小片段的连接问题，不是很好连，但能连的上。
把载体浓度放小一点，目的片段浓度大一点，应该没问题的！
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6楼2011-01-01 19:54:48
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junyanski

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5):鼓励新虫交流 2011-01-01 21:21:17
丫头7976(金币+2): 2011-01-02 08:55:51
嗯 类似这种情况我们也遇到过 不过是做的ta克隆 最后发现是氨苄板出了问题 换了试剂就长出来了 不知道楼主有没有做过阳性转化对照来看 如果也长不出就要怀疑是不是板出了问题
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7楼2011-01-01 20:29:08
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jerry110

新虫 (小有名气)
丫头7976(金币+1): 2011-01-02 08:56:05
路过，看看评论，学了不少东西，呵呵
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8楼2011-01-01 20:47:23
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丫头7976

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2011-01-01 17:31:01:
还有就是连接酶用的哪家的？

连接酶是宝生物的，我不能确定切没切开，做了双酶切后就连接转化了，多谢提点啊
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9楼2011-01-02 08:58:17
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丫头7976

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-01-01 18:14:29:
什么叫跟marker一般亮？你没有做过定量吗？就是把你酶切纯化以后的质粒和基因定量，然后再确定连接的量，不过连接我们一般都是10ul的量，目的基因量多一些，如果没有长的话那肯定就是没有连接上了，不过连接时间可 ...

就是跑电泳后在紫外灯下看，目的条带的亮度和marker的亮度差不多，因为量太少，我不能测，只能估计一下，大概每5ul有50ng，
多谢提点啊
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10楼2011-01-02 09:00:48
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 天使托 at 2011-01-01 18:14:29
什么叫跟marker一般亮？你没有做过定量吗？就是把你酶切纯化以后的质粒和基因定量，然后再确定连接的量，不过连接我们一般都是10ul的量，目的基因量多一些，如果没有长的话那肯定就是没有连接上了，不过连接时间可以 ...

我做的经常有斑，也很均匀，但是质粒酶切总是找不到目的基因，这是为何？
如何消除这种假阳性？

我用PCR快速验证法总是扩不出来，用载体引物都扩不出
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11楼2013-11-06 14:41:56
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