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丫头7976

铜虫 (正式写手)


[交流] 【求助/交流】关于酶切连接转化的问题

大家好,我最近在做酶切,连接,转化,载体是PET-30a大概5420bp 进行了双酶切,切胶纯化,目的片段是300bp双酶切切胶纯化,纯化后i跑了电泳,亮度跟marker差不多,连接时我是目的片段与载体各1ul,酶1ul,6ul体系,和25ul体系都做过,只是做转化时平板都没有长菌,最可能的原因就是没连上吧,还有连接时的目的片段与载体的摩尔比是3-10:1,我不知道这个该怎么算,换算成体积该怎么加,请做过酶切连接并转化的有经验的大侠指教,我将不胜感激。诸位新年快乐,心想事成。
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还有就是连接酶用的哪家的?
3楼2011-01-01 17:31:01
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★ ★
dhd997(金币+2):good,希望你继续加油哦,这几天出台下次VIP奖励制度 2011-01-01 21:20:40
丫头7976(金币+2): 2011-01-02 08:56:41
http://www.promega.com/tbs/9pim180/9pim180.pdf

看看这个里面的摩尔数怎么计算吧。没必要做25ul那么大的连接体系。

至于体积,那是和你的DNA浓度相关的。

你确定感受态、及酶切都不存在问题么?
2楼2011-01-01 17:30:25
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★ ★
dhd997(金币+2):good,希望你继续加油哦,这几天出台下次VIP奖励制度 2011-01-01 21:21:01
丫头7976(金币+2): 2011-01-02 08:58:57
什么叫跟marker一般亮?你没有做过定量吗?就是把你酶切纯化以后的质粒和基因定量,然后再确定连接的量,不过连接我们一般都是10ul的量,目的基因量多一些,如果没有长的话那肯定就是没有连接上了,不过连接时间可以稍微长一些,虽说会出现假阳性,但是你可以用pcr快速验证一下滴!祝实验顺利!
4楼2011-01-01 18:14:29
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引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2011-01-01 17:30:25:
http://www.promega.com/tbs/9pim180/9pim180.pdf

看看这个里面的摩尔数怎么计算吧。没必要做25ul那么大的连接体系。

至于体积,那是和你的DNA浓度相关的。

你确定感受态、及酶切都不存在问题 ...

普洛麦格的说明可以参考一下,不过并不总是这样子的!
5楼2011-01-01 18:15:51
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