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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于酶切连接转化的问题
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丫头7976

铜虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】关于酶切连接转化的问题

大家好，我最近在做酶切，连接，转化，载体是PET-30a大概5420bp 进行了双酶切，切胶纯化，目的片段是300bp双酶切切胶纯化，纯化后i跑了电泳，亮度跟marker差不多，连接时我是目的片段与载体各1ul，酶1ul，6ul体系，和25ul体系都做过，只是做转化时平板都没有长菌，最可能的原因就是没连上吧，还有连接时的目的片段与载体的摩尔比是3-10:1，我不知道这个该怎么算，换算成体积该怎么加，请做过酶切连接并转化的有经验的大侠指教，我将不胜感激。诸位新年快乐，心想事成。
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1楼 2011-01-01 17:15:59
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丫头7976

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-01-01 18:14:29:
什么叫跟marker一般亮？你没有做过定量吗？就是把你酶切纯化以后的质粒和基因定量，然后再确定连接的量，不过连接我们一般都是10ul的量，目的基因量多一些，如果没有长的话那肯定就是没有连接上了，不过连接时间可 ...

就是跑电泳后在紫外灯下看，目的条带的亮度和marker的亮度差不多，因为量太少，我不能测，只能估计一下，大概每5ul有50ng，
多谢提点啊
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10楼2011-01-02 09:00:48
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
★ ★
dhd997(金币+2):good，希望你继续加油哦，这几天出台下次VIP奖励制度 2011-01-01 21:20:40
丫头7976(金币+2): 2011-01-02 08:56:41
http://www.promega.com/tbs/9pim180/9pim180.pdf

看看这个里面的摩尔数怎么计算吧。没必要做25ul那么大的连接体系。

至于体积，那是和你的DNA浓度相关的。

你确定感受态、及酶切都不存在问题么？
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2楼2011-01-01 17:30:25
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
还有就是连接酶用的哪家的？
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3楼2011-01-01 17:31:01
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天使托

专家顾问 (职业作家)
★ ★
dhd997(金币+2):good，希望你继续加油哦，这几天出台下次VIP奖励制度 2011-01-01 21:21:01
丫头7976(金币+2): 2011-01-02 08:58:57
什么叫跟marker一般亮？你没有做过定量吗？就是把你酶切纯化以后的质粒和基因定量，然后再确定连接的量，不过连接我们一般都是10ul的量，目的基因量多一些，如果没有长的话那肯定就是没有连接上了，不过连接时间可以稍微长一些，虽说会出现假阳性，但是你可以用pcr快速验证一下滴！祝实验顺利！
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4楼2011-01-01 18:14:29
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