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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 分子克隆连接问题！
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yitonghui

木虫 (小有名气)

[求助] 分子克隆连接问题！

本人最近想把一个用Xho I 和Nde I双酶切获得的基因片段连接到用同样的酶进行酶切完毕的PET28b（+）质粒中，上述两个酶的说明书（宝生物）说这两个酶进行酶切获得的片段需要按照平末端连接条件进行连接，小弟以前没做过克隆，跪求高手给出个连接条件吧，越详细越好，我都失败一周了。。。。
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1楼 2011-08-26 21:33:45
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

rodickholm

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
yitonghui(金币+5): 2011-08-27 09:05:27
dhd997(金币+3): good 2011-08-27 09:23:04
dhd997: 资料可以上传啊，传上来大家共享啊 2011-08-27 09:23:36
载体和片段mol比

1:10
1:5
1:3
连接，都试试

[(加入载体的量（ ng ）×插入片段大小（ kb ）)/载体大小（ kb ） ]
×插入片段和载体的摩尔比 = 插入片段的量（ ng ）  

可以发封邮件给我，我发些资料给你
rodickholmes@163.com
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2楼2011-08-26 21:45:10
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, MolEPI+1): Good! 2011-08-28 22:56:57
yitonghui(金币+5): 2011-09-13 18:31:26
楼主，你这不是叫大家直接给你把体系什么的弄好吗？
授人以鱼不如授人以渔
其实做连接主要是看你的目的片段和载体酶切纯化后的量了，这个你可以直接定量看看，然后才能确定你的连接体系，一般原则上有公式：1/10<载体质量/载体大小/基因质量/基因的大小<1/3,按照这个公式你就可以直接算出你体系里面的各种物质的添加量了。。。
其实做一个克隆没有必要那么紧张，做的多了，就很随意了，我们现在做克隆，基本看一下就随便加一下，都能连接上的。。。当然了，如果不放心，酶可以稍微多加零点几ul。。。
连接时间9----12h。。。。
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
10楼2011-08-28 22:14:51
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普通回帖

rodickholm

木虫 (正式写手)
是不是自连很多？多半是载体没切开吧，建议买FERMENTAS的快速内切酶
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3楼2011-08-26 21:46:52
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xbl3688

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
yitonghui(金币+5): 2011-08-27 09:05:38
dhd997(金币+3): good 2011-08-27 09:23:49
1、 Xho I和Nde I内切酶切出来的都是粘性末端，PET28b载体中有这两个酶切位点，用普通的T4连接酶都可以的；
2、至于连接条件是跟各公司的酶性质相关的，我列一下我用的两个酶的连接条件：
10ul体系:
        T4ligase buffer     0.5ul
        T4ligase              0.5ul
        目的基因         7ul
        载体             1ul
        ddH2O                1ul
(目的基因与载体的比例可以视回收样品的浓度，片段大小具体情况调整)
TaKaRa公司的T4连接酶，4℃ 24h(或者 16℃ 12h)；
Fermentas公司的T4连接酶，22℃ 3-4h。
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生活的乐趣在于善于发现美，学会欣赏美
4楼2011-08-26 22:28:11
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quiller2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
yitonghui(金币+2): 2011-08-27 09:05:50
dhd997(金币+3): good 2011-08-27 09:24:00
yitonghui(金币+2): 2011-09-13 18:30:14
请注意你的片段,NdeI需要大约9个保护性碱基，这个酶确实不是很好用，所以你可以考虑先将你的片段置入一个载体后，酶切回收下来，然后将28a/b的载体酶切消化后酶连。连接一般没有问题
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致良知
5楼2011-08-26 23:19:14
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wzqno

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
yitonghui(金币+2): 2011-08-27 09:06:11
dhd997(金币+3): good 2011-08-27 09:24:12
你的酶切有没有问题？？Xho I 和Nde I有没有共同的酶切缓冲液？？如果这个不合适，酶切成功率会很低，连接也没有效果的。这个你可以发邮件问问宝生物或者是NEB的专业顾问。如果酶切没有问题，之后的连接，转化的操作都很easy的
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6楼2011-08-27 08:46:29
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wzqno

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

yitonghui(金币+1): 2011-10-07 21:31:04
刚才又查了一下，Xho I 和Nde I的双酶切buffer是1*Hbuffer
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7楼2011-08-27 08:52:51
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zgb1982

木虫 (正式写手)
这可能是不太好连吧，找找看有没有试剂盒可以用
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8楼2011-08-28 09:16:49
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空谷幽风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
西瓜(金币+1): 是的 2011-08-29 16:33:42
yitonghui(金币+1): 2011-10-07 21:31:22
片段怎么得到的，PCR扩出来酶切的还是直接从载体酶切得到的？如果是PCR得到的需要注意保护碱基的数量，粘性末端还是比较容易连的
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a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
9楼2011-08-28 21:16:43
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