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分子克隆连接问题！
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本人最近想把一个用Xho I 和Nde I双酶切获得的基因片段连接到用同样的酶进行酶切完毕的PET28b（+）质粒中，上述两个酶的说明书（宝生物）说这两个酶进行酶切获得的片段需要按照平末端连接条件进行连接，小弟以前没做过克隆，跪求高手给出个连接条件吧，越详细越好，我都失败一周了。。。。 |
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 【分子生物】EPI帖 |
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【答案】应助回帖
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西瓜(金币+5, MolEPI+1): Good! 2011-08-28 22:56:57
yitonghui(金币+5): 2011-09-13 18:31:26
西瓜(金币+5, MolEPI+1): Good! 2011-08-28 22:56:57
yitonghui(金币+5): 2011-09-13 18:31:26
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楼主，你这不是叫大家直接给你把体系什么的弄好吗？ 授人以鱼不如授人以渔 其实做连接主要是看你的目的片段和载体酶切纯化后的量了，这个你可以直接定量看看，然后才能确定你的连接体系，一般原则上有公式：1/10<载体质量/载体大小/基因质量/基因的大小<1/3,按照这个公式你就可以直接算出你体系里面的各种物质的添加量了。。。 其实做一个克隆没有必要那么紧张，做的多了，就很随意了，我们现在做克隆，基本看一下就随便加一下，都能连接上的。。。当然了，如果不放心，酶可以稍微多加零点几ul。。。 连接时间9----12h。。。。 |
10楼2011-08-28 22:14:51
rodickholm
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【答案】应助回帖
★ ★ ★
yitonghui(金币+5): 2011-08-27 09:05:27
dhd997(金币+3): good 2011-08-27 09:23:04
dhd997: 资料可以上传啊，传上来大家共享啊 2011-08-27 09:23:36
yitonghui(金币+5): 2011-08-27 09:05:27
dhd997(金币+3): good 2011-08-27 09:23:04
dhd997: 资料可以上传啊，传上来大家共享啊 2011-08-27 09:23:36
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载体和片段mol比 1:10 1:5 1:3 连接，都试试 [(加入载体的量（ ng ）×插入片段大小（ kb ）)/载体大小（ kb ） ] ×插入片段和载体的摩尔比 = 插入片段的量（ ng ） 可以发封邮件给我，我发些资料给你 rodickholmes@163.com |
2楼2011-08-26 21:45:10
rodickholm
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3楼2011-08-26 21:46:52
xbl3688
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【答案】应助回帖
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yitonghui(金币+5): 2011-08-27 09:05:38
dhd997(金币+3): good 2011-08-27 09:23:49
yitonghui(金币+5): 2011-08-27 09:05:38
dhd997(金币+3): good 2011-08-27 09:23:49
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1、 Xho I和Nde I内切酶切出来的都是粘性末端，PET28b载体中有这两个酶切位点，用普通的T4连接酶都可以的； 2、至于连接条件是跟各公司的酶性质相关的，我列一下我用的两个酶的连接条件： 10ul体系: T4ligase buffer 0.5ul T4ligase 0.5ul 目的基因 7ul 载体 1ul ddH2O 1ul (目的基因与载体的比例可以视回收样品的浓度，片段大小具体情况调整) TaKaRa公司的T4连接酶，4℃ 24h(或者 16℃ 12h)； Fermentas公司的T4连接酶，22℃ 3-4h。 |
4楼2011-08-26 22:28:11
