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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 分子克隆连接问题！
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, MolEPI+1): Good! 2011-08-28 22:56:57
yitonghui(金币+5): 2011-09-13 18:31:26
楼主，你这不是叫大家直接给你把体系什么的弄好吗？
授人以鱼不如授人以渔
其实做连接主要是看你的目的片段和载体酶切纯化后的量了，这个你可以直接定量看看，然后才能确定你的连接体系，一般原则上有公式：1/10<载体质量/载体大小/基因质量/基因的大小<1/3,按照这个公式你就可以直接算出你体系里面的各种物质的添加量了。。。
其实做一个克隆没有必要那么紧张，做的多了，就很随意了，我们现在做克隆，基本看一下就随便加一下，都能连接上的。。。当然了，如果不放心，酶可以稍微多加零点几ul。。。
连接时间9----12h。。。。
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
10楼2011-08-28 22:14:51
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智能机器人

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我们都爱小木虫

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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5): good 2011-08-29 07:37:11
西瓜(MolEPI+1): 追加！ 2011-08-29 16:37:02
yitonghui(金币+5): 2011-09-13 18:31:46
这两个酶都是很好切的，以上几位主要关注在连接上；现在我来说点其它可能与你实验不成功有关的。
1.设计引物时酶切位点前需要加保护碱基，如果不加肯定切不开，对这两个酶来说都加四个保护碱基肯定没有问题
2.大部分质粒是Amp抗性的，但pET28a/b/c是Kan抗性，这个搞错了也不会长
3.感受态细胞如果效率低的话也不太容易成功
4.热击转化时间一般20ul的体系42度45s即可，100ul体系42度90s
5.如果你表达的蛋白是细胞毒性的，因LB的蛋白胨里含有微量的乳糖，细胞毒性蛋白的表达会杀死细胞，在LB中加入0.5％的葡萄糖可以避免这种情况的出现
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11楼2011-08-29 00:42:18
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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, MolEPI+1): 学习了！ 2011-08-29 16:35:03
yitonghui(金币+2): 2011-09-17 20:44:30
引用回帖:
12楼: Originally posted by longage.gene at 2011-08-29 10:23:12:
关于第5点想请教。为啥换葡萄糖没事，乳糖就不行？

pET28是受T7 RNA聚合酶启动的(强启动子、不是一般的强)Lac表达调控，可受IPTG和乳糖诱导，乳糖诱导的实质是当大肠利用乳糖做为碳源时，乳糖在细胞内首先经乳糖分解酶分解，产生一分子的贝塔半乳糖，细胞内只要有极微量的贝塔半乳糖存在，Lac抑制调控就会被相应的解除，这个时候细胞毒性蛋白就会被不量表达，下边的后继的情况就是杀死细胞了。
大肠杆菌还有另个一个特点，在有葡萄糖存在的情况下会优先利用葡萄糖做为碳源，其它任何的碳源都靠边站，因此，在有葡萄糖存在时乳糖就不会被分解，就不产生贝塔半乳糖
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13楼2011-08-29 10:42:05
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