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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 分子克隆连接问题！
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yitonghui

木虫 (小有名气)

[求助] 分子克隆连接问题！

本人最近想把一个用Xho I 和Nde I双酶切获得的基因片段连接到用同样的酶进行酶切完毕的PET28b（+）质粒中，上述两个酶的说明书（宝生物）说这两个酶进行酶切获得的片段需要按照平末端连接条件进行连接，小弟以前没做过克隆，跪求高手给出个连接条件吧，越详细越好，我都失败一周了。。。。
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1楼 2011-08-26 21:33:45
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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5): good 2011-08-29 07:37:11
西瓜(MolEPI+1): 追加！ 2011-08-29 16:37:02
yitonghui(金币+5): 2011-09-13 18:31:46
这两个酶都是很好切的，以上几位主要关注在连接上；现在我来说点其它可能与你实验不成功有关的。
1.设计引物时酶切位点前需要加保护碱基，如果不加肯定切不开，对这两个酶来说都加四个保护碱基肯定没有问题
2.大部分质粒是Amp抗性的，但pET28a/b/c是Kan抗性，这个搞错了也不会长
3.感受态细胞如果效率低的话也不太容易成功
4.热击转化时间一般20ul的体系42度45s即可，100ul体系42度90s
5.如果你表达的蛋白是细胞毒性的，因LB的蛋白胨里含有微量的乳糖，细胞毒性蛋白的表达会杀死细胞，在LB中加入0.5％的葡萄糖可以避免这种情况的出现
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11楼2011-08-29 00:42:18
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rodickholm

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
yitonghui(金币+5): 2011-08-27 09:05:27
dhd997(金币+3): good 2011-08-27 09:23:04
dhd997: 资料可以上传啊，传上来大家共享啊 2011-08-27 09:23:36
载体和片段mol比

1:10
1:5
1:3
连接，都试试

[(加入载体的量（ ng ）×插入片段大小（ kb ）)/载体大小（ kb ） ]
×插入片段和载体的摩尔比 = 插入片段的量（ ng ）  

可以发封邮件给我，我发些资料给你
rodickholmes@163.com
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2楼2011-08-26 21:45:10
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rodickholm

木虫 (正式写手)
是不是自连很多？多半是载体没切开吧，建议买FERMENTAS的快速内切酶
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3楼2011-08-26 21:46:52
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xbl3688

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
yitonghui(金币+5): 2011-08-27 09:05:38
dhd997(金币+3): good 2011-08-27 09:23:49
1、 Xho I和Nde I内切酶切出来的都是粘性末端，PET28b载体中有这两个酶切位点，用普通的T4连接酶都可以的；
2、至于连接条件是跟各公司的酶性质相关的，我列一下我用的两个酶的连接条件：
10ul体系:
        T4ligase buffer     0.5ul
        T4ligase              0.5ul
        目的基因         7ul
        载体             1ul
        ddH2O                1ul
(目的基因与载体的比例可以视回收样品的浓度，片段大小具体情况调整)
TaKaRa公司的T4连接酶，4℃ 24h(或者 16℃ 12h)；
Fermentas公司的T4连接酶，22℃ 3-4h。
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生活的乐趣在于善于发现美，学会欣赏美
4楼2011-08-26 22:28:11
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