| 查看: 3436 | 回复: 12 | |||
| 本帖产生 3 个 MolEPI ，点击这里进行查看 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
[求助]
分子克隆连接问题！
|
|||
本人最近想把一个用Xho I 和Nde I双酶切获得的基因片段连接到用同样的酶进行酶切完毕的PET28b（+）质粒中，上述两个酶的说明书（宝生物）说这两个酶进行酶切获得的片段需要按照平末端连接条件进行连接，小弟以前没做过克隆，跪求高手给出个连接条件吧，越详细越好，我都失败一周了。。。。 |
回复此楼» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有235人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
-
留学--博士招生
已经有16人回复
-
化学工程，本211，求调剂，ab区不限
已经有4人回复
-
邵阳学院食品与化学工程学院硕士调剂
已经有0人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
ganchao1776
至尊木虫 (职业作家)
- MolEPI: 12
- 应助: 18 (小学生)
- 金币: 11613.1
- 散金: 1811
- 红花: 30
- 帖子: 3402
- 在线: 900.8小时
- 虫号: 330935
- 注册: 2007-03-24
- 性别: GG
- 专业: 生物大分子结构与功能
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5): good 2011-08-29 07:37:11
西瓜(MolEPI+1): 追加！ 2011-08-29 16:37:02
yitonghui(金币+5): 2011-09-13 18:31:46
dhd997(金币+5): good 2011-08-29 07:37:11
西瓜(MolEPI+1): 追加！ 2011-08-29 16:37:02
yitonghui(金币+5): 2011-09-13 18:31:46
|
这两个酶都是很好切的，以上几位主要关注在连接上；现在我来说点其它可能与你实验不成功有关的。 1.设计引物时酶切位点前需要加保护碱基，如果不加肯定切不开，对这两个酶来说都加四个保护碱基肯定没有问题 2.大部分质粒是Amp抗性的，但pET28a/b/c是Kan抗性，这个搞错了也不会长 3.感受态细胞如果效率低的话也不太容易成功 4.热击转化时间一般20ul的体系42度45s即可，100ul体系42度90s 5.如果你表达的蛋白是细胞毒性的，因LB的蛋白胨里含有微量的乳糖，细胞毒性蛋白的表达会杀死细胞，在LB中加入0.5％的葡萄糖可以避免这种情况的出现 |
11楼2011-08-29 00:42:18
rodickholm
木虫 (正式写手)
- 应助: 28 (小学生)
- 金币: 2044.2
- 散金: 1564
- 红花: 7
- 帖子: 675
- 在线: 235.3小时
- 虫号: 562916
- 注册: 2008-05-24
- 性别: GG
- 专业: 农业昆虫学
【答案】应助回帖
★ ★ ★
yitonghui(金币+5): 2011-08-27 09:05:27
dhd997(金币+3): good 2011-08-27 09:23:04
dhd997: 资料可以上传啊，传上来大家共享啊 2011-08-27 09:23:36
yitonghui(金币+5): 2011-08-27 09:05:27
dhd997(金币+3): good 2011-08-27 09:23:04
dhd997: 资料可以上传啊，传上来大家共享啊 2011-08-27 09:23:36
|
载体和片段mol比 1:10 1:5 1:3 连接，都试试 [(加入载体的量（ ng ）×插入片段大小（ kb ）)/载体大小（ kb ） ] ×插入片段和载体的摩尔比 = 插入片段的量（ ng ） 可以发封邮件给我，我发些资料给你 rodickholmes@163.com |
2楼2011-08-26 21:45:10
rodickholm
木虫 (正式写手)
- 应助: 28 (小学生)
- 金币: 2044.2
- 散金: 1564
- 红花: 7
- 帖子: 675
- 在线: 235.3小时
- 虫号: 562916
- 注册: 2008-05-24
- 性别: GG
- 专业: 农业昆虫学
3楼2011-08-26 21:46:52
xbl3688
银虫 (正式写手)
- MolEPI: 1
- 应助: 12 (小学生)
- 金币: 1240.1
- 红花: 1
- 帖子: 311
- 在线: 104.7小时
- 虫号: 1348397
- 注册: 2011-07-17
- 性别: GG
- 专业: 生物大分子结构与功能
【答案】应助回帖
★ ★ ★
yitonghui(金币+5): 2011-08-27 09:05:38
dhd997(金币+3): good 2011-08-27 09:23:49
yitonghui(金币+5): 2011-08-27 09:05:38
dhd997(金币+3): good 2011-08-27 09:23:49
|
1、 Xho I和Nde I内切酶切出来的都是粘性末端，PET28b载体中有这两个酶切位点，用普通的T4连接酶都可以的； 2、至于连接条件是跟各公司的酶性质相关的，我列一下我用的两个酶的连接条件： 10ul体系: T4ligase buffer 0.5ul T4ligase 0.5ul 目的基因 7ul 载体 1ul ddH2O 1ul (目的基因与载体的比例可以视回收样品的浓度，片段大小具体情况调整) TaKaRa公司的T4连接酶，4℃ 24h(或者 16℃ 12h)； Fermentas公司的T4连接酶，22℃ 3-4h。 |
4楼2011-08-26 22:28:11
