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分子克隆连接问题！
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本人最近想把一个用Xho I 和Nde I双酶切获得的基因片段连接到用同样的酶进行酶切完毕的PET28b（+）质粒中，上述两个酶的说明书（宝生物）说这两个酶进行酶切获得的片段需要按照平末端连接条件进行连接，小弟以前没做过克隆，跪求高手给出个连接条件吧，越详细越好，我都失败一周了。。。。 |
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ganchao1776
至尊木虫 (职业作家)
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【答案】应助回帖
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西瓜(金币+5, MolEPI+1): 学习了！ 2011-08-29 16:35:03
yitonghui(金币+2): 2011-09-17 20:44:30
西瓜(金币+5, MolEPI+1): 学习了！ 2011-08-29 16:35:03
yitonghui(金币+2): 2011-09-17 20:44:30
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pET28是受T7 RNA聚合酶启动的(强启动子、不是一般的强)Lac表达调控，可受IPTG和乳糖诱导，乳糖诱导的实质是当大肠利用乳糖做为碳源时，乳糖在细胞内首先经乳糖分解酶分解，产生一分子的贝塔半乳糖，细胞内只要有极微量的贝塔半乳糖存在，Lac抑制调控就会被相应的解除，这个时候细胞毒性蛋白就会被不量表达，下边的后继的情况就是杀死细胞了。 大肠杆菌还有另个一个特点，在有葡萄糖存在的情况下会优先利用葡萄糖做为碳源，其它任何的碳源都靠边站，因此，在有葡萄糖存在时乳糖就不会被分解，就不产生贝塔半乳糖 |
13楼2011-08-29 10:42:05
rodickholm
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【答案】应助回帖
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yitonghui(金币+5): 2011-08-27 09:05:27
dhd997(金币+3): good 2011-08-27 09:23:04
dhd997: 资料可以上传啊，传上来大家共享啊 2011-08-27 09:23:36
yitonghui(金币+5): 2011-08-27 09:05:27
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dhd997: 资料可以上传啊，传上来大家共享啊 2011-08-27 09:23:36
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载体和片段mol比 1:10 1:5 1:3 连接，都试试 [(加入载体的量（ ng ）×插入片段大小（ kb ）)/载体大小（ kb ） ] ×插入片段和载体的摩尔比 = 插入片段的量（ ng ） 可以发封邮件给我，我发些资料给你 rodickholmes@163.com |
2楼2011-08-26 21:45:10
rodickholm
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3楼2011-08-26 21:46:52
xbl3688
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yitonghui(金币+5): 2011-08-27 09:05:38
dhd997(金币+3): good 2011-08-27 09:23:49
yitonghui(金币+5): 2011-08-27 09:05:38
dhd997(金币+3): good 2011-08-27 09:23:49
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1、 Xho I和Nde I内切酶切出来的都是粘性末端，PET28b载体中有这两个酶切位点，用普通的T4连接酶都可以的； 2、至于连接条件是跟各公司的酶性质相关的，我列一下我用的两个酶的连接条件： 10ul体系: T4ligase buffer 0.5ul T4ligase 0.5ul 目的基因 7ul 载体 1ul ddH2O 1ul (目的基因与载体的比例可以视回收样品的浓度，片段大小具体情况调整) TaKaRa公司的T4连接酶，4℃ 24h(或者 16℃ 12h)； Fermentas公司的T4连接酶，22℃ 3-4h。 |
4楼2011-08-26 22:28:11
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